孫炳新，蘇 陽(yáng)，郝婷婷，祈 巖，馮敘橋，，*

(1.渤海大學(xué)食品科學(xué)研究院，渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，“食品貯藏加工及質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心”遼寧省高校重大科技平臺(tái)，遼寧錦州121013; 2.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110866)

魚油的提取工藝主要有蒸煮法、稀堿水解法、低溫提油法、酶解法和超臨界流體萃取法等。其中蒸煮法提取時(shí)間長(zhǎng)、溫度高，魚油容易氧化變質(zhì)，出油率低［1］;低溫提油法需要制冷裝置，分離效率低，魚油酸價(jià)高［2］;酶解法雖然條件溫和，不過(guò)酶一般不容易保存，易失活;超臨界流體萃取法雖然具有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、臨界溫度不是很高等優(yōu)點(diǎn)，但是超臨界流體萃取是高壓技術(shù)，對(duì)設(shè)備要求較高，故投資大，消耗資金較多［3］。而魚油的稀堿水解提取法利用稀堿液水解脂肪組織中的蛋白質(zhì)，破壞蛋白質(zhì)與油脂的結(jié)合，更好地促進(jìn)魚油的釋放。該法具有出油率高、產(chǎn)品色澤淺、游離脂肪酸含量少等優(yōu)點(diǎn)［4-6］。草魚(Ctenopharyngodon idellus)作為我國(guó)特有的溫水性淡水養(yǎng)殖種類，是全國(guó)產(chǎn)量最大的養(yǎng)殖對(duì)象之一［7］。草魚脂肪中含有大量的魚油，魚油的特征脂肪酸是富含ω-3系的多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFA)，如二十碳五烯酸(Eicosapentenoic acid，EPA)和二十二碳六烯酸(Docosahexenoic acid，DHA)［8］。草魚的魚油一般存在于腹部和內(nèi)臟中，這些部分一般被作為下腳料，如果將它們排放到自然界中不僅會(huì)污染環(huán)境，還會(huì)造成資源浪費(fèi)，而如果能充分利用這些物質(zhì)，不僅可以提高魚類生產(chǎn)加工的附加值，還能夠有效減少環(huán)境污染，帶來(lái)更大的經(jīng)濟(jì)效益。本實(shí)驗(yàn)以草魚的肝臟和脂肪為原料，研究提取魚油的條件對(duì)魚油品質(zhì)的影響及其脂肪酸的組成，為開發(fā)高價(jià)值魚油產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

春季草魚 市售，個(gè)體約1500g，每次鮮魚購(gòu)回后，24h內(nèi)處理完畢;氫氧化鈉、氫氧化鉀、氯化鈉、無(wú)水乙醇、硫酸、無(wú)水乙醚、石油醚、甲醇、苯、濃磷酸均為分析純，沈陽(yáng)化工實(shí)驗(yàn)廠;37種脂肪酸甲酯混標(biāo)Sigma公司。

電子分析天平 FA224型，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;絞肉機(jī) KDR-183-1型，天津市達(dá)康電器公司;實(shí)驗(yàn)精密酸度計(jì) PHS-3C型，上海精密儀器儀表有限公司;DK-S24型恒溫水浴鍋、DHG型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;臺(tái)式高速離心機(jī) TDL-5-A型，上海安亭科學(xué)儀器廠;氣相色譜儀 CP-3800/3900型，瓦里安。

1.2 原料的預(yù)處理

將購(gòu)回的新鮮草魚用重物敲擊其頭部，取其肝臟和脂肪，用水清洗幾次，除去血漬雜物等，將表面水瀝干后，用絞肉機(jī)將其絞碎，置于冰箱內(nèi)冷藏。每個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)采用同一批次樣品，分別稱取同質(zhì)量的肝臟和脂肪，不同因素可采用不同批次的樣品，置于冰箱內(nèi)冷藏的樣品應(yīng)在2d內(nèi)用完，否則應(yīng)棄之。

1.3 原料的基本理化指標(biāo)

1.3.1 水分含量的測(cè)定 采用常壓干燥法，在恒重的稱量皿中精確稱取試樣5g，放入105℃烘箱中烘干1h，取出稱量皿，立即放入干燥器內(nèi)冷卻至常溫，稱量烘干后重量。重復(fù)以上步驟進(jìn)行復(fù)烘，復(fù)烘時(shí)間為30m in，直到前后兩次質(zhì)量差值小于0.002g為止。

式中:m1-烘干前稱皿和試樣重量(g);m2-烘干后稱樣皿和試樣重量(g);m-稱樣皿重量(g)。

1.3.2 粗脂肪含量的測(cè)定 采用索氏抽提法，將處理好的樣品裝入濾紙筒放入索氏提取器內(nèi)，連接已干燥至恒重的脂肪接收瓶，由冷凝管上端加入無(wú)水石油醚，加量為接受瓶體積的2/3，于水浴上加熱使石油醚不斷的回流提取，提取6h左右，并按式2計(jì)算脂肪含量。

式中:m1-接受瓶的質(zhì)量(g);m2-接受瓶和脂肪的質(zhì)量(g);m-樣品的質(zhì)量(g)。

1.4 魚油的提取工藝

均勻稱取20g肝臟和脂肪(1∶1)的混合樣品→加入20g蒸餾水，攪拌均勻→水浴升溫→NaOH(1∶1，W/V)調(diào)pH→繼續(xù)升溫→加入魚糜質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%濃度4%NaCl溶液保溫鹽析→3500r/min趁熱離心10min→用移液槍收集上層油脂即為粗魚油。

1.5 魚油的精制

脫膠:30℃以下加入一定體積(油重的1%～1.5%)的濃磷酸(濃度90%～94%)，再加入油重約2%～4%的熱水，反應(yīng) 2～10m in，2000r/min離心10m in去除膠質(zhì)，得到脫膠魚油。

脫酸:測(cè)定魚油的酸價(jià)，計(jì)算用堿量，配制成15%的NaOH溶液，攪拌后加入，升溫至60℃，停止攪拌，靜置沉降，放出油腳。取油重20%的淡鹽水(8%)洗滌1～2遍，加熱至65℃真空脫水。

1.6 魚油提取率及品質(zhì)測(cè)定

1.6.1 魚油提取率的計(jì)算方法

1.6.2 魚油品質(zhì)測(cè)定 碘價(jià):采用硫代硫酸鈉滴定法，參照GB/T5532-1995;酸價(jià):采用氫氧化鈉滴定法，參照GB/T5530-1998;過(guò)氧化值:采用硫代硫酸鈉回滴法，參照GB/T538-1995;含皂量:采用鹽酸回滴法，參照GB/T5533-1985。以上各指標(biāo)均重復(fù)測(cè)定三次。

1.7 草魚提取條件對(duì)提取率及魚油品質(zhì)的影響

1.7.1 水解溫度對(duì)草魚魚油提取率及特性的影響 為了研究水解溫度對(duì)草魚魚油提取率及特性的影響，按照1.4中所述的實(shí)驗(yàn)工藝，將水解溫度設(shè)置為35、45、55、65℃，其他工藝參數(shù)分別為NaOH(1∶1，W/V)調(diào) pH9，鹽析溫度為 60℃，NaCl保溫鹽析5min。

1.7.2 pH對(duì)草魚魚油提取率及性質(zhì)的影響 為了研究pH對(duì)草魚魚油提取率及性質(zhì)的影響，按照1.4中所述的實(shí)驗(yàn)工藝，將pH設(shè)為7、8、9和10，其他工藝參數(shù)為水解溫度分別為45℃，NaOH(1∶1，W/V)調(diào)pH后，鹽析溫度為60℃，NaCl保溫鹽析5m in。

1.7.3 鹽析溫度對(duì)草魚魚油提取率及性質(zhì)的影響 為了研究鹽析溫度對(duì)草魚魚油提取率及性質(zhì)的影響，按照1.4中所述的實(shí)驗(yàn)工藝，將鹽析溫度設(shè)置為50、60、70、80℃，其他工藝參數(shù)分別為水解溫度45℃，NaOH(1∶1，W/V)調(diào)pH9，NaCl保溫鹽析5min。

1.7.4 鹽析時(shí)間對(duì)草魚魚油提取率及性質(zhì)的影響 為了研究鹽析時(shí)間對(duì)草魚魚油提取率及性質(zhì)的影響，按照1.4中所述的實(shí)驗(yàn)工藝，將鹽析時(shí)間設(shè)置為2、5、9、13m in，其他工藝參數(shù)分別為水解溫度45℃，NaOH(1∶1，W/V)調(diào)pH9，鹽析的溫度為60℃。

1.8 脂肪酸組成

采用氣相色譜法［9］(gas chromatography，GC)對(duì)樣品進(jìn)行脂肪酸組成分析。首先將樣品進(jìn)行甲酯化前處理，本實(shí)驗(yàn)按照寇秀穎等［10］的方法進(jìn)行甲酯化，目的是為了通過(guò)改善樣品的揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性、分離度以及靈敏度來(lái)使樣品更適于氣相色譜的分析。其次將甲酯化后的魚油用微量注射器移入氣相分析儀中進(jìn)行分析。具體的甲酯化方法和氣相色譜的分析條件如下。

KOH-甲醇甲酯化:稱取油脂或脂肪酸50mg置于10m L容量瓶?jī)?nèi)，加入2m L石油醚和苯的混合溶劑(1∶1)，輕輕搖動(dòng)使之溶解。再加入2m L 0.4mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液，混勻。在室溫靜置不同時(shí)間，加蒸餾水使全部有機(jī)相甲酯溶液升至瓶頸上部，澄清后吸取上清液。

GC分析條件:色譜柱:cp-sil8CB毛細(xì)管柱(30m ×0.25mm×0.25μm);升溫程序:40℃保持2m in，以3℃/m in升至 260℃，保持 1m in;載氣(He)流速1.2m L/m in，壓力2.4kPa，進(jìn)樣量1μL;分流比1∶35。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

顯著性方差分析方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同批次草魚的基本理化指標(biāo)

由表1可知，草魚的肝臟和脂肪(1∶1)混合物含水率在45%左右，粗脂肪含量在25%左右，其他的物質(zhì)可能是蛋白質(zhì)等成分。

表1 草魚不同批次的基本理化指標(biāo)Table1 Basic physicochemical property of different batches of Ctenopharyngodon idellus

2.2 萃取條件對(duì)稀堿水法提取魚油及品質(zhì)的影響

2.2.1 水解溫度對(duì)草魚魚油提取率及性質(zhì)的影響 由表2可知，水解溫度對(duì)魚油的提取率有顯著的影響(p＜0.05)。魚油的提取率隨溫度的升高而升高，魚油在45℃時(shí)的提取率明顯高于35℃時(shí)的提取率，而當(dāng)溫度高于45℃時(shí)，魚油提取率隨溫度的升高呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。分析原因是水解溫度過(guò)高時(shí)，由于脂肪組織中的蛋白質(zhì)凝固變性，將油脂包裹其中，阻礙了油脂的析出，因此魚油的提取率隨溫度的升高而下降。同時(shí)由表2可以看出，隨著水解溫度的升高，過(guò)氧化值和含皂量也逐漸升高，其中過(guò)氧化值可反映氧化程度，皂化價(jià)可反映穩(wěn)定程度，而表2中顯示過(guò)氧化值和含皂量都升高，這是因?yàn)樵诟邷叵卖~油與堿液接觸，加快了魚油的氧化速度，產(chǎn)生了大量的皂化物，降低了魚油的品質(zhì)。綜上分析，為保證魚油的品質(zhì)，水解溫度不宜過(guò)高，魚油適宜的水解溫度為45℃。

2.2.2 pH對(duì)草魚魚油提取率及性質(zhì)的影響 由表3可知，魚油的提取率隨著pH的升高而增大，當(dāng)pH由7.0增加到8.0時(shí)，提取率明顯增高，表明提高pH可促進(jìn)脂肪組織的水解，將更多的魚油釋放出來(lái)。pH過(guò)高也會(huì)影響油脂的不飽和程度，當(dāng)pH為9.0時(shí)，油脂的碘價(jià)最高，說(shuō)明不飽和程度最高。而酸價(jià)是檢驗(yàn)脂肪中游離脂肪酸含量的標(biāo)志，植物油中的游離脂肪酸用氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，每克油消耗氫氧化鉀的毫克數(shù)，稱為酸價(jià)。酸價(jià)越小，說(shuō)明油脂質(zhì)量越高，油脂越穩(wěn)定，新鮮度和精煉程度越好［11］。所以當(dāng)pH為10.0時(shí)油脂最穩(wěn)定。當(dāng)pH為10.0時(shí)，過(guò)氧化值最低，表明氧化程度最小。綜合考慮，草魚魚油提取過(guò)程中最宜采用的pH為10.0。

2.2.3 鹽析時(shí)間對(duì)草魚魚油提取率及性質(zhì)的影響 隨著鹽析時(shí)間的延長(zhǎng)，草魚魚油的提取率逐漸增大，但是過(guò)氧化值逐漸升高，說(shuō)明隨著鹽析時(shí)間的延長(zhǎng)，魚油逐漸氧化，過(guò)氧化值逐漸升高(表4)，并且鹽析的溫度也會(huì)導(dǎo)致魚油脂肪酸的分解，所以綜合考慮，草魚魚油提取過(guò)程中最宜采用的鹽析時(shí)間為5min。

表2 水解溫度對(duì)草魚魚油提取率及性質(zhì)的影響Table2 Effect of hydrolysis temperature on extraction ratio and property of Ctenopharyngodon idellus oil

表3 pH對(duì)草魚魚油提取率及性質(zhì)的影響Table3 Effect of pH on extraction ratio and properties of Ctenopharyngodon idellus oil

2.2.4 鹽析溫度對(duì)草魚魚油提取率及性質(zhì)的影響由表5可知，當(dāng)鹽析溫度為60℃時(shí)，提取率最高，與50℃相比增高較明顯，之后隨著溫度的升高，提取率逐漸下降，同時(shí)隨著溫度的升高，過(guò)氧化值逐漸增加，碘價(jià)逐漸降低，分析原因是由于隨著鹽析溫度的增加，魚油脂肪酸鏈的不穩(wěn)定，被氧化程度較高，從而使油脂的不飽和度降低，而碘價(jià)的分析主要反映了油脂的不飽和程度［12］，油脂的碘價(jià)越高則說(shuō)明不飽和程度越高，所以綜上分析，草魚魚油提取過(guò)程中最適宜的鹽析溫度為60℃。

表4 鹽析時(shí)間對(duì)草魚魚油提取率及性質(zhì)的影響Table4 Effect of salting-out time on extraction ratio and property of Ctenopharyngodon idellus oil

表5 鹽析溫度對(duì)草魚魚油提取率及性質(zhì)的影響Table5 Effect of salting-out temperature on extraction ratio and property of Ctenopharyngodon idellus oil

表6 精制草魚魚油脂肪酸含量Table6 Fatty acids in refined Ctenopharyngodon idellus oil

2.2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 由上述實(shí)驗(yàn)得到的最適提取參數(shù)，根據(jù)魚油的提取工藝及精制工藝重新從魚糜中提取魚油，最終得到魚油的提取率為 84.81% ± 0.56%，碘價(jià)(100.35±0.45)gI2/100g，酸價(jià)(0.68± 0.17)mg KOH/g，過(guò)氧化值(0.79±0.04)meq/kg，含皂量0.30%±0.03%。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)與原實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)沒有顯著差異，說(shuō)明所選實(shí)驗(yàn)條件較好，是最優(yōu)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。適用于工業(yè)生產(chǎn)。

2.3 草魚魚油脂肪酸組成分析

精制后的草魚魚油脂肪酸的氣相色譜圖見圖1。分析結(jié)果表明，草魚魚油的脂肪酸中飽和脂肪酸占30%左右，其中以硬脂酸和花生酸為主，還含有少量的月桂酸、十五烷酸、棕櫚酸和十七烷酸;不飽和脂肪酸占60%左右，其中單不飽和脂肪酸主要是由棕櫚油酸、十七碳一烯酸、反式油酸、二十碳一烯酸、油酸及芥酸構(gòu)成，占脂肪酸含量的37%左右，油酸和十七碳一烯酸占絕大多數(shù);多不飽和脂肪酸主要是由n3及n6系列構(gòu)成，含量在23%左右，主要由γ-亞麻酸、α-亞麻酸、二十碳二烯酸、二十碳三烯酸、EPA及DHA構(gòu)成(表6)。

圖1 精制草魚魚油脂肪酸組成氣相色譜圖Fig.1 GC chromatogram of fatty acids in refined Ctenopharyngodon idellus oil

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)與譚汝成等［13］的實(shí)驗(yàn)有相似性，但是最后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果在pH對(duì)提取率的影響的趨勢(shì)上和經(jīng)過(guò)氣相色譜分析后的脂肪酸的組成和含量都有所不同。本實(shí)驗(yàn)的脂肪酸組成要比譚汝成所做的鰱魚的脂肪酸組成多一些硬脂酸，如月桂酸和十七烷酸，分析原因是:雖然都是提取，但是提取的材料不同;同時(shí)所處的實(shí)驗(yàn)環(huán)境及實(shí)驗(yàn)條件也不盡相同，采用的脂肪酸的混標(biāo)也不一樣。

以草魚腹內(nèi)脂肪和肝臟為原料，采用稀堿水解提取法制備草魚魚油時(shí)，水解液pH、水解溫度、鹽析時(shí)間與鹽析溫度等提取條件對(duì)魚油的提取率、碘價(jià)、酸價(jià)、過(guò)氧化值和含皂量具有重要影響。通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到的影響草魚魚油提取工藝的最佳條件為脂肪和肝臟(1∶1)的混合樣品，加入與魚糜同比例的蒸餾水，攪拌均勻于45℃ pH10.0氫氧化鈉溶液(1∶1，W/V)中水解5m in，加入魚糜質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的4% NaCl溶液后在60℃下鹽析5min。在該條件下提取的魚油的提取率為84.81%±0.56%，碘價(jià)為(100.35 ±0.45)g I2/100g，酸價(jià)為(0.68±0.17)mg KOH/g，過(guò)氧化值為(0.79±0.04)meq/kg，含皂量為0.30% ± 0.03%，表明在這種條件下提取出來(lái)的魚油的品質(zhì)是最好的。同時(shí)經(jīng)過(guò)脂肪酸成分分析得到:魚油中含有16∶0、18∶1n-9、C18∶2n6c等22種脂肪酸，飽和脂肪酸占30%左右，不飽和脂肪酸含量較多，占60%左右，其中單不飽和脂肪酸占脂肪酸含量的37%左右，多不飽和脂肪酸主要是由n3及n6系列構(gòu)成，含量在23%左右。本實(shí)驗(yàn)以提取率、酸價(jià)、碘值、過(guò)氧化值、含皂量為指標(biāo)，研究了提取因素對(duì)魚油品質(zhì)的影響，實(shí)驗(yàn)可為進(jìn)一步研究影響魚油的氧化條件提供理論基礎(chǔ)，對(duì)如何保持魚油的品質(zhì)、更全面的了解魚油的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及藥用價(jià)值，提供一定的參考作用。

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