隗黎麗，楊竹青，王自蕊，熊六鳳，周秋白

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西 南昌 330045)

真核細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)主要被2 種不同的蛋白酶解系統(tǒng)所降解:溶酶體途徑和泛素－蛋白酶體途徑(ubiquitin proteasome pathway，UPP)。其中UPP 途徑通過識(shí)別蛋白質(zhì)N 端不穩(wěn)定的氨基酸信號(hào)，對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白高度特異性降解，在細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、遺傳信息的復(fù)制與表達(dá)、染色體結(jié)構(gòu)及功能等常見的生命現(xiàn)象中發(fā)揮著極其重要的作用。泛素－蛋白質(zhì)結(jié)合物的形成需要3 種酶催化泛素傳遞的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，這3 種酶分別為泛素激活酶(E1)、泛素結(jié)合酶(E2)和泛素連接酶(E3)。其中，E3泛素連接酶負(fù)責(zé)確定蛋白質(zhì)泛素化的特異性，識(shí)別靶蛋白底物，并在引發(fā)26S 的蛋白酶體降解蛋白質(zhì)的過程中起著極其重要的作用［1－2］。

神經(jīng)調(diào)節(jié)素受體降解蛋白1(neuregulin receptor degradation protein-1，Nrdp1)是一種新的E3泛素連接酶，可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡等過程［3－5］。Nrdp1 也稱為RNF41(ring finger protein 41)和FLRF(fetal liver ring finger)［6］。Nrdpl 起初是從小鼠造血干細(xì)胞和造血前體細(xì)胞的cDNA 文庫(kù)中鑒定出來，隨即Diamonii 等［6］發(fā)現(xiàn)Nrdpl 可與神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白受體ErbB3 及ErbB4 以一種非依賴于激活的方式互作，并報(bào)道了該蛋白具有RBCC 家族的典型結(jié)構(gòu)特點(diǎn):由一個(gè)環(huán)指結(jié)構(gòu)、一個(gè)B-box 結(jié)構(gòu)和一個(gè)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)共同組成。此后Qiu 等［7］證實(shí):Nrdp1 是一種E3泛素化連接酶，它可以泛素化EtbB3 并通過蛋白酶降解ErbB3;此外，作為環(huán)指類泛素E3連接酶，Nrdp1 還可以發(fā)生自身的泛素化;另一方面，Nrdp1 氨基端的RING 結(jié)構(gòu)可以加強(qiáng)ErbB3 的降解，而其羧基端卻作為Nrdp1 的顯性負(fù)效應(yīng)形式而使EthB3 的水平得以提高。由于上皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR/ErbB)家族在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及分化過程中起著關(guān)鍵作用，ErbB3的過表達(dá)將會(huì)導(dǎo)致腫瘤，Nrdp1 通過對(duì)ErbB3 的調(diào)節(jié)來影響神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白相關(guān)信號(hào)的效應(yīng)，并最終影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖及分化過程。最新的研究表明，Nrdpl 作為E3泛素連接酶，通過促進(jìn)MyD88 的泛素化和降解抑制MyD88 依賴的NF －κB 的活化和炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并通過促進(jìn)TBK1 的泛素化活化IRF3 促進(jìn)I 型IFN 的產(chǎn)生，在TLR 的信號(hào)傳導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用，并且在細(xì)菌感染和病毒感染中對(duì)機(jī)體起到保護(hù)性的效應(yīng)［8－10］。目前在人類、鼠等高等動(dòng)物中都克隆得到了Nrdp1 基因，并深入研究了其在免疫中的功能［8－10］。在低等脊椎動(dòng)物中，尤其在魚類中對(duì)Nrdp1 的研究還比較少，僅在斑馬魚中克隆和鑒定了 Nrdp1［11］。

草魚(Ctenopharyngodon idella)是我國(guó)重要的淡水魚類養(yǎng)殖品種，具有生長(zhǎng)快、飼料蛋白需求低、肉質(zhì)好等優(yōu)點(diǎn)。隨著養(yǎng)殖密度的增大和養(yǎng)殖環(huán)境的惡化，草魚細(xì)菌性和病毒性疾病頻繁爆發(fā)，常引起草魚大批死亡，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。草魚疾病防御及對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力的研究工作已成為當(dāng)務(wù)之急。為深入開展草魚免疫及其機(jī)制的研究，并在此基礎(chǔ)上尋找防治草魚疾病的有效方法，本研究克隆了草魚Nrdp1(gcNrdp1)全長(zhǎng)cDNA，在獲得的Nrdp1 序列的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了氨基酸序列分析，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的性質(zhì)和二級(jí)結(jié)構(gòu)，為深入研究其在魚類免疫中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

2011 年1 月在江西省新建縣一漁場(chǎng)購(gòu)買了一批草魚，體質(zhì)量在15 ～20 g。將購(gòu)買的材料魚在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)暫養(yǎng)1 周后(每日1 次投喂商品顆粒飼料)，取魚剖殺，分離新鮮的組織提取RNA。

1.2 核酸的提取和cDNA 模板的合成

采用Invitrogen 公司的Trizol 試劑盒提取總RNA，操作過程中(包括組織總RNA 提取以及應(yīng)用RNA的一切相關(guān)實(shí)驗(yàn))所用離心管和槍頭等需經(jīng)1 g/L 焦碳酸二乙酯(diethylpryocarbonate，DEPC)水處理過夜，玻璃器皿及金屬器械需經(jīng)180 ℃高溫烘烤6 h 以上使RNase 徹底失活。RNA 的具體提取方法參考試劑盒的說明書進(jìn)行。cDNA 合成按SMART cDNA Synthesis Kit 操作手冊(cè)進(jìn)行。

1.3 草魚Nrdp1 cDNA 全長(zhǎng)的獲得

1.3.1 草魚Nrdp1 cDNA 中間片段克隆 根據(jù)已報(bào)道的斑馬魚(登錄號(hào):NM213516.1)和虹鱒(登錄號(hào):NM001141259.1)，用DNAMAN 分析保守性，在保守區(qū)內(nèi)用Primer Premier 5.0 軟件，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物(表1)，引物由武漢博杰生物技術(shù)有限公司合成。以提取的總RNA 為模板，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明逆轉(zhuǎn)錄成第一條 cDNA 鏈。PCR 擴(kuò)增條件為 95 ℃預(yù)變性 3 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共 35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳、切膠和回收純化后克隆到pMD18 －Tvector (TaKaRa，Tokyo，Japan)，然后再轉(zhuǎn)化到感受態(tài)TOP10，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，菌液PCR 檢測(cè)陽性克隆送上海華諾生物技術(shù)有限公司測(cè)序，獲得中間片段。

表1 gcNrdp1 基因擴(kuò)增和表達(dá)所用引物Tab.1 Primers used to amplify and express the grass carp Nrdp1 gene

1.3.2 草魚Nrdp1 cDNA 3’端片段克隆 gcNrdp1 cDNA 3’端片段克隆擴(kuò)增時(shí)共設(shè)計(jì)4 條引物，GSPP1、NGSPP1、3’RACE Olig(T)－ Adaptor 和 3’RACE Adaptor，其中 GSPP1 和 NGSPP1 是根據(jù)已獲得中間片段序列而設(shè)計(jì)的特異性引物，并且GSPP1 在NGSPP1 的上游;3’RACE Olig(T)－Adaptor 和3’RACE Adaptor 是1 對(duì)通用引物。反轉(zhuǎn)錄時(shí)，用3’RACE Olig(T)－Adaptor 代替反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的Olig(T)用于 mRNA 反轉(zhuǎn)錄;擴(kuò)增時(shí)，用 GSPP1 和3’RACE Adaptor 做第1 次 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共20 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。產(chǎn)物稀釋后再用 NGSPP1和3’RACE Adaptor 做巢式PCR，反應(yīng)條件同上。PCR 產(chǎn)物驗(yàn)證方法同中間片段的克隆。

1.3.3 Nrdp1 cDNA 5’端片段克隆 gcNrdp1 cDNA 5’端片段克隆擴(kuò)增時(shí)共設(shè)計(jì) 5 條引物，GSPP2、GSPP3、NGSPP3、5’RACE Olig(T)－ Adaptor 和 5’RACE Adaptor，其中 GSPP2 和 NGSPP2 是根據(jù)已獲得中間片段序列而設(shè)計(jì)的特異性引物，并且GSPP2 在NGSPP2 的下游;5’RACE Olig(T)－Adaptor 和5’RACE Adaptor 是1 對(duì)通用引物。首先，用特異性引物GSPP2 代替反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的Olig(T)在Mulv 逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA 的第一鏈，用DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0(Code:DV807A)純化試劑盒將cDNA 純化。其次，在純化產(chǎn)物cDNA3’端加一個(gè)Poly(A)尾巴。取純化cDNA 10 μL，5 ×TdT buffer10 μL，1 g/LBSA 5 μL，dATP(10 mmol/L)2.5 μL，TdT 酶 1 μL，H2O21.5 μL，37 ℃保溫 30 min后80 ℃終止反應(yīng)3 min，產(chǎn)物用H2O 稀釋為0.5 mL 后－20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｗ詈?，進(jìn)行巢式PCR，方法步驟同3’端片段克隆。

1.4 序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

利用ExPASy 網(wǎng)站(http://www.expasy.org)的Translate 程序進(jìn)行氨基酸序列推導(dǎo);使用NCBI 上的BLASTp 軟件進(jìn)行同源基因搜索;采用 SignalP4.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/signalP/)預(yù)測(cè)蛋白的信號(hào)肽，跨膜區(qū)預(yù)測(cè)用TMHMM 軟件;蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析使用Predicprotein 軟件，采用Pfam (http://www.sanger.ac.uk/software/pfam)搜索保守的結(jié)構(gòu)域。氨基酸序列比對(duì)用 ClustalW1.81 軟件分析;同源基因的序列相似性采用DNASTAR 軟件包中的MEGALIGN 程序分析;系統(tǒng)發(fā)育樹則采用Mega 4.1 軟件中的 N-J 法進(jìn)行構(gòu)建。

表2 用于氨基酸序列比較和進(jìn)化樹構(gòu)建的基因登錄號(hào)Tab.2 Nucleotide sequences of Nrdp1 used for phylogenetic tree construction and multiple sequence alignments

1.5 草魚不同組織中Nrdp1 轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)

取3 尾草魚分離其肝臟、頭腎、脾臟、肝臟、腸道、心臟、胸腺、鰓、腦和肌肉組織各100 mg 以及血液100 μL 用于提取總RNA，取2 μL 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用RT-PCR 方法檢測(cè)在草魚個(gè)體各組織器官中Nrdp1 的表達(dá)水平。所用引物見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 草魚Nrdp1 cDNA 全長(zhǎng)及推到的氨基酸序列特征

以草魚肝臟組織總cDNA 為模板，通過簡(jiǎn)并引物進(jìn)行巢式PCR，獲得770 bp 擴(kuò)增片段;通過3’和5’RACE-PCR 擴(kuò)增，分別獲得長(zhǎng)度為797 bp 和523 bp 的擴(kuò)增片段，序列拼接獲得的Nrdp1 基因cDNA全長(zhǎng)為1 865 bp (GenBank 登錄號(hào):JX864048)，其中5’和3’非翻譯區(qū)的長(zhǎng)度分別為291 bp 和620 bp，在3’非翻譯區(qū)發(fā)現(xiàn)2 個(gè)mRNA 不穩(wěn)定信號(hào)(ATTTA)和1 個(gè)多聚腺苷酸加尾信號(hào)(ATTAAA)(圖1)。該基因開放閱讀框?yàn)?54 bp，編碼318 個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量大小為36.09 ku，pH 為7.0 時(shí)理論等電點(diǎn)為5.83。使用SignalP4.0 預(yù)測(cè)gcNrdp1 無信號(hào)肽，TMHMM 預(yù)測(cè)gcNrdp1 無跨膜螺旋。其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋為主，無規(guī)則卷曲和延伸鏈構(gòu)成了蛋白中量最大的結(jié)構(gòu)原件，不含β－折疊。使用‘Pfam’(http://www.sanger.ac.uk/software/pfam)搜索保守的結(jié)構(gòu)域，顯示 gcNrdp1 存在 RING 結(jié)構(gòu)域 (aa 18-56)和Pfam 結(jié)構(gòu)域 (aa 137-315)。

2.2 序列同源性

使用DNASTAR 的Magalign 軟件將gcNrdp1 和其它物種Nrdp1 氨基酸序列進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明，gcNrdp1 的核苷酸及推測(cè)氨基酸序列與所列舉的4 種動(dòng)物的一致性均較高，gcNrdp1 與GenBank 中斑馬魚Danio rerio 的Nrdp1 的部分序列相似性最高(98%);與虹鱒Oncorhynchus mykiss Nrdp1 的相似性為94%，與哺乳動(dòng)物人Homo sapiens 和小鼠Mus musculus 的相似性均為89%。

2.3 構(gòu)建Nrdp1 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

應(yīng)用MEGA4.0 軟件對(duì)草魚和其他8 種其它脊椎動(dòng)物的Nrdp1 氨基酸序列按鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示gcNrdp1 與斑馬魚和虹鱒的在一個(gè)大分支上，與斑馬魚在一個(gè)小分支上，表明其分子進(jìn)化地位與斑馬魚最近。

2.4 草魚Nrdp1 mRNAs 在草魚體內(nèi)不同組織器官內(nèi)的表達(dá)

通過半定量RT-PCR 方法研究了草魚Nrdp1 在11 種組織中的表達(dá)，結(jié)果表明，Nrdp1 在所檢測(cè)的組織中均可表達(dá)，呈組成型表達(dá)(圖4)。在心臟中的表達(dá)量最為豐富，其次為腦，在肌肉和血液中表達(dá)量則相對(duì)較低。

圖1 Nrdp1 的核酸序列和推斷的氨基酸序列Fig.1 The nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of gcNrdp1

圖2 草魚Nrdp1 和其他物種的氨基酸多序列比對(duì)Fig.2 Multiple alignment of grass carp Nrdp1 from other species

圖3 不同物種的Nrdp1 系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of Nrdp1 gene

圖4 RT-PCR 檢測(cè)草魚Nrdp1 的組織特異性表達(dá)Fig.4 Tissue-specific expression of Nrdp1 mRNA in grass carp

3 結(jié)論與討論

Nrdpl 作為一種E3泛素連接酶，在TLR 的信號(hào)傳導(dǎo)過程中發(fā)揮著重要作用，并且在細(xì)菌感染和病毒感染中對(duì)機(jī)體具有保護(hù)性作用［8－10］。目前對(duì)魚類Nrdp1 基因的研究還很少，僅在斑馬魚中有報(bào)道。Maddirevula 等對(duì)斑馬魚的Nrdp1 克隆測(cè)序并對(duì)氨基酸的序列進(jìn)行同源比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)斑馬魚的Nrdp1 與人和鼠的同源性為90%，與人和鼠的Nrdp1 相比，斑馬魚的Nrdp1 有高度保守的B-box 和螺旋卷曲結(jié)構(gòu)。通過鄰接分析法構(gòu)建進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)鼠和人的Nrdp1 的距離非常近，而斑馬魚和哺乳動(dòng)物的關(guān)系非常近［11］。之前，Yen 等研究也發(fā)現(xiàn)Nrdp1 保守性非常高，老鼠和人的Nrdp1 由317 個(gè)氨基酸組成，相似性達(dá)到了100%［4］。本研究通過NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘和基因克隆及測(cè)序獲得了草魚的Nrdp1 基因，該基因編碼318 個(gè)氨基酸，與其他物種的相似性在89% ～98%，其中與斑馬魚的序列相似性達(dá)到了98%，保守性非常高，其氨基酸序列的高度保守意味著Nrdp1 在生命功能上的重要性。本研究通過鄰接法建樹結(jié)果顯示草魚Nrdp1 與斑馬魚和虹鱒在一個(gè)大分支上，與斑馬魚在一個(gè)小分支上，表明其分子進(jìn)化地位與斑馬魚最近。此外，結(jié)構(gòu)域分析顯示其存在特征的鋅指結(jié)構(gòu)域，該種結(jié)構(gòu)域在E3泛素連接酶中具有保守性。因此推測(cè)本研究所克隆的基因是E3泛素連接酶中家族中的成員。

Nrdp1 在不同物種的各組織中有廣泛的表達(dá)，但不同物種的不同組織的表達(dá)量存在一定的差異。Diamonti 等報(bào)道Nrdp1 在成人各組織中具有廣泛的分布，尤其在心臟和大腦中表達(dá)豐富［6］。此外，Maddirevula 等在斑馬魚的胚胎發(fā)育的研究中也發(fā)現(xiàn)Nrdp1 主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中腦中表達(dá)［11］。本研究發(fā)現(xiàn)草魚Nrdp1 在不同組織中的表達(dá)模式呈現(xiàn)組成型表達(dá)，但在心臟和腦中表達(dá)量較高，在肌肉和血液中的表達(dá)則最少，這與Diamonti 等［6］和Maddirevula 等［11］報(bào)道的結(jié)果比較一致。Nrdp1 基因在不同物種中廣泛存在并高度保守，而且在同一物種體內(nèi)各器官均有表達(dá)，表明該基因在生命活動(dòng)中可能具有重要作用。總的來說，本研究的結(jié)果將為進(jìn)一步開展草魚Nrdp1 的體外表達(dá)、生理功能驗(yàn)證和基因的調(diào)控機(jī)理等研究工作奠定了基礎(chǔ)。

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