王 鑫，徐麗萍

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院省高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150076）

大豆低聚肽是大豆蛋白經(jīng)酶解作用處理后得到的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，除氨基酸組成與大豆蛋白一樣具有優(yōu)質(zhì)蛋白的特點(diǎn)以外，還具有大豆蛋白所不具備的良好的溶解性、穩(wěn)定性等理化性質(zhì)，而且具有易吸收和低過敏原性、降低血脂和膽固醇、降低血壓、促進(jìn)礦物質(zhì)吸收和脂肪代謝、增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)員體能等多種生理功能[1]。隨著生物技術(shù)的進(jìn)步和生命科學(xué)的發(fā)展，大豆肽的生理功能逐步被人們發(fā)現(xiàn)，一些活性肽的結(jié)構(gòu)和生理功能逐漸明確，推動(dòng)了活性肽的研究，也促進(jìn)了大豆肽的研究與開發(fā)。美國在70年代初研制出大豆肽產(chǎn)品，建成了年產(chǎn)5000t食用大豆肽的工廠。日本于80年代開展此方面的研究，雪印和森永等乳業(yè)公司均已成功地將大豆肽應(yīng)用于食品工業(yè)中[2]。但此時(shí)他們生產(chǎn)的大豆低聚肽也多用酸解法、堿解法和氫解法，這樣生產(chǎn)的肽化學(xué)物質(zhì)難以除盡、苦味重[3]。我國對(duì)于大豆低聚肽的研究開發(fā)起步較晚，于80年代中后期才開始興起，基礎(chǔ)和應(yīng)用研究都很薄弱，目前仍處于起步階段。有研究表明，大豆分離蛋白酶解物具有清除羥自由基的能力，清除能力主要與暴露的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)和肽序列有關(guān)[4]。大豆低聚肽能夠及時(shí)修復(fù)運(yùn)動(dòng)過程中損傷的骨骼肌細(xì)胞，維持骨骼肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性。同時(shí)，能夠增加睪酮的分泌，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成。其抗疲勞機(jī)制可能通過提高肝糖原的儲(chǔ)備、降低血乳酸含量，通過增強(qiáng)SOD活性，抑制氧自由基的釋放及提高免疫功能發(fā)揮抗疲勞作用。人體實(shí)驗(yàn)證實(shí)，大豆低聚肽能夠有助于減輕運(yùn)動(dòng)后疲勞[5]。

通過實(shí)驗(yàn)探討大豆低聚肽對(duì)小鼠的抗疲勞及抗氧化作用，為新型營養(yǎng)補(bǔ)劑的開發(fā)提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。對(duì)有效利用我國豐富的大豆資源，提高大豆的利用價(jià)值，并向高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)員提供新型健康的抗疲勞保健食品具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆低聚肽 自制；紐崔萊蛋白粉 成都安利日用品有限公司；小鼠 體重18～22g，6～8周齡、基礎(chǔ)飼料 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室；總抗氧化能力測(cè)定試劑盒、抗超氧陰離子自由基測(cè)試盒、血尿素氮測(cè)試盒、肌糖原及肝糖原測(cè)定試劑盒 南京建成科技有限公司；水楊酸 天津市泰興化學(xué)試劑有限公司；亞油酸 上海市精細(xì)化學(xué)品研究所；硫代巴比妥酸 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

TGL-16G型臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；FSH-2型可調(diào)高速勻漿器，微量移液器 上海安亭微量進(jìn)樣器廠；TU-1900型紫外分光光度計(jì) 北京普析通用有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

準(zhǔn)確稱量25g大豆分離蛋白，木瓜蛋白酶與堿性蛋白酶按2∶1的比例加入1g，用蒸餾水溶解，攪拌混勻，然后定容到500m L，將溶液調(diào)至pH為7，于55℃水溶液中酶解2h，取濾液濃縮冷凍干燥后為大豆低聚肽，待用于小鼠的灌胃。

1.2.1 動(dòng)物的分組及喂養(yǎng) 取40只小白鼠隨機(jī)分為5個(gè)組，每組8只，雌雄各半。5個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別為：陰性對(duì)照組（CG）蒸餾水灌胃，3個(gè)劑量組大豆低聚肽溶液灌胃，其劑量分別為2.0g/kg（LD）、4.0g/kg（MD）、8.0g/kg（HD）；陽性對(duì)照組（WPC）紐崔萊蛋白溶液灌胃，劑量為4.0g/kg[6]。采用灌胃法，每天給小鼠灌胃不同劑量的受試物，對(duì)照組給予同等體積的蒸餾水灌胃，每天一次，小鼠自由攝食鼠糧與飲水，連續(xù)15d[7]。然后進(jìn)行各項(xiàng)抗疲勞指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.2 大豆低聚肽抗氧化活性的研究

1.2.2.1 總抗氧化能力測(cè)定 配制不同濃度的大豆低聚肽及VC溶液，并按照總抗氧化能力測(cè)定試劑盒的說明書嚴(yán)格要求操作。

定義：在37℃時(shí)，每分鐘每毫升樣品使反應(yīng)體系的吸光值每增加0.01時(shí)為一個(gè)總抗氧化能力單位。

總抗氧化能力（單位/毫升樣品）=（測(cè)定管吸光度-對(duì)照管吸光度）/（0.01×30）×（反應(yīng)液總體積/取樣量）×樣品測(cè)試前的稀釋倍數(shù)

1.2.2.2 抑制超氧陰離子自由基能力測(cè)定 按照超氧陰離子自由基及產(chǎn)生超氧陰離子自由基測(cè)定試劑盒說明書嚴(yán)格要求操作。

定義：在反應(yīng)系統(tǒng)中，每升樣品在37℃反應(yīng)40m in所抑制的超氧自由基相當(dāng)于1mg的維生素C所抑制的超氧陰離子自由基的變化為一個(gè)活力單位。

式中：Ai—對(duì)照管吸光度；AS—測(cè)定管吸光度；Aj—標(biāo)準(zhǔn)管吸光度；C—標(biāo)準(zhǔn)管濃度（0.15mg/m L）；V—1000m L；n—樣品測(cè)試前稀釋倍數(shù)。

1.2.2.3 抑制羥自由基能力測(cè)定 在25m L容量瓶中依次加入2mmol/L FeSO43m L、1mmol/L H2O23m L，搖勻，接著加入6mmol/L水楊酸3m L，加入蒸餾水補(bǔ)充至25m L，搖勻，于37℃水浴加熱60m in后取出，測(cè)其吸光度A0。分別加入1mg/m L大豆低聚肽溶液及VC溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0m L于25m L容量瓶中，同樣加入2mmol/L FeSO43m L、1mmol/L H2O23m L，搖勻，接著加入6mmol/L水楊酸3m L，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，水浴加熱60m in，取出測(cè)其吸光度Ai。按式（2）計(jì)算待測(cè)液清除率，待測(cè)液對(duì)羥自由基（·OH）清除率為：

式中：A1—加樣液時(shí)溶液的吸光度；A0—不加樣液時(shí)溶液的吸光度。

1.2.2.4 抑制烷自由基能力測(cè)定 分別準(zhǔn)確吸取1mg/m L大豆低聚肽溶液及VC溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0m L與0.1m L亞油酸混合，加入5m L乙醇，5m L 0.1mol/L磷酸緩沖液（pH=8.0）、用10W紫外燈的紫外光照射120m in。然后加入4m L 20%三氯乙酸（W/V）、1m L 3%硫代巴比妥酸（W/V），95℃水浴反應(yīng)90min，冰浴冷卻，離心，于532nm處比色，A0為以蒸餾水代替試樣作為空白組的吸光度。根據(jù)式（3）計(jì)算清除率，待測(cè)液對(duì)烷基自由基（ROO·）清除率為：

式中：A1—加樣液時(shí)溶液的吸光度；A0—不加樣液時(shí)溶液的吸光度。

1.2.3 大豆低聚肽抗疲勞作用的研究

1.2.3.1 力竭游泳時(shí)間的測(cè)定 連續(xù)灌胃15d，末次灌胃30m in后，將小鼠置于游泳箱中游泳。水深約25cm，水溫（25±1.0）℃，鼠尾根部負(fù)荷5%體重的鉛皮[4]。記錄小鼠自游泳開始至力竭的時(shí)間（以鼻孔下沉為判斷標(biāo)準(zhǔn)），作為小鼠力竭游泳時(shí)間[8]。

1.2.3.2 血漿尿素氮（BUN）含量的測(cè)定 連續(xù)灌胃15d，末次給小鼠灌胃后，次日，在溫度為25℃的水中不負(fù)重游泳30m in。運(yùn)動(dòng)后休息15m in后立即斷頭采血0.2m L，用肝素來對(duì)血漿進(jìn)行抗凝。采血后完畢，立即2000r/min離心15min，取血清20μL并于520nm波長比色，測(cè)定血漿尿素值，計(jì)算血漿尿素氮含量（測(cè)定方法及尿素氮含量計(jì)算公式詳見血尿素氮試劑盒）[9]。

1.2.3.3 肝糖原含量的測(cè)定 連續(xù)灌胃15d，末次給小鼠灌胃后，次日，在溫度為25℃的水中不負(fù)重游泳30m in。運(yùn)動(dòng)后休息15m in后立即處死，取肝臟經(jīng)生理鹽水漂洗后用濾紙吸干，精確稱取肝臟100mg，將肝臟與堿液按1∶3加入試管后進(jìn)行勻漿制成水解液，并置于沸水浴中20min，流水冷卻，將肝糖原水解液配制成1%檢測(cè)液，同時(shí)配制空白與標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻，沸水浴5m in，冷卻，于620nm波長比色，計(jì)算肝糖原含量（測(cè)定方法及肝糖原含量計(jì)算公式詳見肝糖原含量測(cè)定試劑盒）。

1.2.3.4 肌糖原含量的測(cè)定 連續(xù)灌胃15d，末次給小鼠灌胃后，次日，在溫度為25℃的水中不負(fù)重游泳30m in。運(yùn)動(dòng)后休息15m in后立即處死，取股四頭肌經(jīng)生理鹽水漂洗后用濾紙吸干，精確稱取股四頭肌100mg，將肌肉與堿液按1∶3加入試管后進(jìn)行勻漿制成水解液，并置于沸水浴中20min，流水冷卻，將肝肌糖原水解液配制成5%檢測(cè)液，同時(shí)配制空白與標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻，沸水浴5m in，冷卻，于620nm波長比色，計(jì)算肌糖原含量（測(cè)定方法及肝糖原含量計(jì)算公式詳見肌糖原含量測(cè)定試劑盒）。

2 結(jié)果與討論

2.1 動(dòng)物的分組及喂養(yǎng)結(jié)果分析

對(duì)小鼠進(jìn)行連續(xù)灌胃15d后，陰性、陽性對(duì)照組和大豆低聚肽的高、中、低劑量組小鼠體重差異結(jié)果見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)過程對(duì)小鼠生長發(fā)育的影響Table1 The effectof the experiments onmice growth

由表1可知，小鼠在喂養(yǎng)15d后體重均表現(xiàn)出增長的趨勢(shì)。說明高脂飼料能夠?qū)е滦∈篌w重明顯增加，飼料誘導(dǎo)高血脂大鼠模型制備成功。

2.2 大豆低聚肽抗氧化活性的研究結(jié)果分析

2.2.1 大豆低聚肽總抗氧化能力測(cè)定結(jié)果分析 由圖1可知，大豆低聚肽顯現(xiàn)出一定的抗氧化能力，隨著大豆低聚肽的濃度增大，總抗氧化能力越強(qiáng)，但低于參比VC的抗氧化能力。因此，在該實(shí)驗(yàn)中，大豆低聚肽總抗氧化能力最大為13.86U/m L。

圖1 總抗氧化能力測(cè)定Fig.1 Determination of total antioxidant capacity

2.2.2 大豆低聚肽抗超氧陰離子能力測(cè)定結(jié)果分析

由圖2可知，不同濃度的大豆低聚肽對(duì)超氧陰離子的產(chǎn)生都有一定的清除作用，且隨著大豆低聚肽濃度的增加，抗超氧陰離子自由基的效果增強(qiáng)。O·是活性氧的一種，是機(jī)體壽命最長的自由基，通常作為自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的引發(fā)劑，產(chǎn)生活性更強(qiáng)的·OH自由基，進(jìn)一步給機(jī)體造成危害?？梢姶蠖沟途垭膶?duì)O·有一定的清除作用。因此，在該實(shí)驗(yàn)中，大豆低聚肽抗超氧陰離子自由基能力最大為158.67U/L。

圖2 抗超氧陰離子自由基能力的測(cè)定Fig.2 Determination of superoxide anion radical scavenging

2.2.3 大豆低聚肽對(duì)羥自由基清除效果的結(jié)果分析

由圖3可知，隨著大豆低聚肽濃度的升高，其對(duì)羥自由基的清除率逐漸升高，但是變化不明顯；VC對(duì)羥自由基的清除率同樣隨著濃度升高而升高，但當(dāng)加入大于2m L VC時(shí)，其清除率就已達(dá)到100%；在0.5～2.0m L范圍內(nèi)，VC的清除率約為大豆低聚肽的10倍，因此說明了大豆低聚肽對(duì)羥自由基具有一定的抗氧化效果。因此，在該實(shí)驗(yàn)中，大豆低聚肽抗超氧對(duì)羥自由基的最大抑制率為17.11%。

圖3 羥自由基能力測(cè)定Fig.3 Determination of hydroxyl radical

圖4 清除烷基自由基能力測(cè)定Fig.4 Determination of alkyl radicals capability

2.2.4 大豆低聚肽對(duì)烷基自由基清除效果的結(jié)果分析 由圖4可知，隨著大豆低聚肽濃度的升高，其對(duì)烷基自由基的清除率逐漸升高，變化趨勢(shì)明顯，但略低于參比VC清除率。因此說明了大豆低聚肽具有和VC相當(dāng)?shù)目寡趸ЧＴ谠搶?shí)驗(yàn)中，大豆低聚肽抗超氧對(duì)對(duì)烷基自由基的最大抑制率為31.97%。

2.3 大豆低聚肽抗疲勞作用研究結(jié)果分析

2.3.1 大豆低聚肽對(duì)小鼠力竭游泳時(shí)間的結(jié)果分析

由圖5可知，力竭游泳時(shí)間最長的為高劑量組（45.51± 1.39）m in，最短的為陰性對(duì)照組（33.76±2.68）m in；三個(gè)劑量組和陽性對(duì)照組的力竭游泳時(shí)間明顯高于陰性對(duì)照組，并且差異顯著（p＜0.05）；中、高劑量組之間差異不顯著。力竭游泳測(cè)試是常用的抗疲勞測(cè)試方法[10]。疲勞是機(jī)體活動(dòng)到達(dá)一定程度后產(chǎn)生的一種自我保護(hù)的生理機(jī)制，可以防止威脅生命的過度機(jī)能衰竭，而力竭游泳時(shí)間可以最直觀地體現(xiàn)受試物的抗疲勞功效[11]。在宏觀上體現(xiàn)出大豆低聚肽良好的抗疲勞效果。

圖5 大豆低聚肽對(duì)各組小鼠游泳時(shí)間的影響Fig.5 The effectof soybean oligopeptides on swimming time for each group ofmice

圖6 大豆低聚肽對(duì)各組小鼠BUN含量的影響Fig.6 The effect of soybean oligopeptides on BUN levels for each group ofmice

2.3.2 大豆低聚肽對(duì)小鼠BUN含量的結(jié)果分析 由圖6可知，在小鼠力竭游泳之后，BUN含量最高的為陰性對(duì)照組（18.15±0.38）mmol/L，含量最低的為高劑量組（17.05±0.33）mmol/L；灌喂大豆低聚肽的劑量組和陽性對(duì)照組的BUN含量均低于陰性對(duì)照組；并且劑量組的BUN含量有降低趨勢(shì)。BUN是體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝的最終產(chǎn)物，主要在肝細(xì)胞中生成。對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)蛋白質(zhì)分解代謝強(qiáng)度常以BUN濃度以及汗液、尿液中排出的尿素氮量來加以估計(jì)。生理?xiàng)l件下BUN維持穩(wěn)定，蛋白質(zhì)的分解代謝沒有顯著增強(qiáng)。進(jìn)行長時(shí)間運(yùn)動(dòng)時(shí)，體力消耗則導(dǎo)致蛋白質(zhì)分解代謝增強(qiáng)，BUN濃度呈坡型升高。體內(nèi)缺乏糖原時(shí)，就利用蛋白質(zhì)的分解來彌補(bǔ)糖的不足。故BUN也作為評(píng)價(jià)運(yùn)動(dòng)性疲勞強(qiáng)度的重要指標(biāo)[12]。由此可見，大豆低聚肽能夠減少能源物質(zhì)的消耗，具有抗疲勞效果。

2.3.3 大豆低聚肽對(duì)小鼠肝糖原含量的結(jié)果分析及評(píng)價(jià) 由圖7可知，在小鼠力竭游泳之后，肝糖原含量最高的為高劑量組（17.45±0.36）mg/g，含量最低的為陰性對(duì)照組（11.51±0.55）mg/g；灌喂大豆低聚肽的劑量組和陽性對(duì)照組的肝糖原含量均明顯高于陰性對(duì)照組；并且劑量組的肝糖原含量有比較明顯的升高趨勢(shì)。研究證明，在力竭運(yùn)動(dòng)之后，需要通過分解肝糖原為機(jī)體提供能量。肝臟不斷輸出葡萄糖，是血液中葡萄糖最重要的調(diào)節(jié)器官，內(nèi)源性的葡萄糖有75%左右來自肝糖原分解，其余5%來自糖異生作用[7]。因此肝糖原存儲(chǔ)量可視為體內(nèi)能源物質(zhì)的評(píng)價(jià)指標(biāo)[13]。由此可見，大豆低聚肽可增加體內(nèi)肝糖原的含量，為機(jī)體供能，具有抗疲勞效果。

圖7 大豆低聚肽對(duì)各組小鼠肝糖原含量的影響Fig.7 The effectof soybean oligopeptides on liver glycogen levels for each group ofmice

圖8 大豆低聚肽對(duì)各組小鼠肌糖原含量的影響Fig.8 The effectof soybean oligopeptides onmuscle glycogen levels for each group ofmice

2.3.4 大豆低聚肽對(duì)小鼠肌糖原含量的結(jié)果分析及評(píng)價(jià) 由圖8可知，在小鼠力竭游泳之后，肌糖原含量最高的為中劑量（1.53±0.09）mg/g，含量最低的為陰性對(duì)照組（0.93±0.07）mg/g；灌喂大豆低聚肽的劑量組和陽性對(duì)照組的肌糖原含量均明顯高于陰性對(duì)照組；中、高劑量組的肌糖原含量相當(dāng)，且均高于低劑量組。肌糖原是肌肉中糖的儲(chǔ)存形式，在劇烈運(yùn)動(dòng)消耗大量血糖時(shí)，肌糖原分解供能，肌糖元不能直接分解成葡萄糖，必須先分解產(chǎn)生乳酸，經(jīng)血液循環(huán)到肝臟，再在肝臟內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)楦翁窃蚍纸獬善咸烟?。因此肌糖原存?chǔ)量也可視為體內(nèi)能源物質(zhì)的評(píng)價(jià)指標(biāo)。由此可見，大豆低聚肽可增加體內(nèi)肌糖原的含量，為機(jī)體提供儲(chǔ)備能量，具有抗疲勞效果。

3 結(jié)論

以大豆低聚肽為原料，對(duì)其抗氧化活性及抗疲勞作用進(jìn)行了研究。通過與VC對(duì)比，對(duì)大豆低聚肽清除自由基的能力進(jìn)行測(cè)定并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究其抗疲勞作用。得出以下結(jié)論：

3.1 大豆低聚肽具有一定的抗氧化活性，總抗氧化能力最大為13.86U/m L，抗超氧陰離子自由基能力最大為158.67U/L，對(duì)羥自由基的最大抑制率為17.11%，對(duì)烷基自由基的最大抑制率為31.97%。

3.2 大豆低聚肽具有較好的抗疲勞效果，其中力竭游泳時(shí)間最長為高劑量組45.51m in，BUN含量最低為高劑量組17.05mmol/L，肝糖原含量最高為高劑量組17.45mg/g，肌糖原最高含量為中劑量組1.53mg/g。

[1]鄧成萍，張惠，魏秀英.大豆低聚肽的研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2004，25（增刊）：236-240.

[2]張延坤，劉炳智.大豆肽在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J].食品工業(yè)，1997（3）：5-6.

[3]王永楨.“生物活性多肽”：生命的活力之源[J].當(dāng)代經(jīng)濟(jì)，2003（5）：4-5.

[4]潘進(jìn)權(quán)，劉耘.大豆多肽研究概況[J].中國調(diào)味品，2003，288（2）：6-10.

[5]A Hirose，K Miyashita.Inhibitory effect of proteins and their hydrolysates on the oxidation of triacylylycerds containing docosahexaenoic acids inemulsio[J].Jap Soc Food Sci Technol，1999，46：799-805.

[6]劉娜，李湘濃，吳翱.大豆寡肽抗疲勞作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2010，14（2）：201-203.

[7]Ma L，CaiDL，Tong B，etal.Anti-fatigue effects of salidroside inmice[J].JournalofMedical co Ueges of PLA，2008，23：88-93.

[8]張維杰.糖復(fù)合生化技術(shù)研究[M].杭州：浙江大學(xué)出版社，1999：12-13.

[9]王彥武，傅偉忠，譚宗艷，等.枸杞多糖抗疲勞作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國熱帶醫(yī)學(xué)，2006，6（8）：1522-1523.

[10]索有瑞，王洪倫，李玉林，等.柴達(dá)木盆地唐古特白刺籽油的抗疲勞作用[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2006，18：88-91.

[11]Niranjan R，Eresha M，Won KJ，et al.Purification of a radical scavenging peptide from fermented mussel sauce and its antioxidant properties[J].Food Research International，2005，38：175-182.

[12]胡永欣，肖國強(qiáng).運(yùn)動(dòng)時(shí)氨基酸代謝對(duì)疲勞的影響[J].現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)，2001，7（4）：310-312

[13]高珊，童英，熊曉燕.蒽酮法與試劑盒法測(cè)定糖原含量的比較研究[J].首都公共衛(wèi)生，2011，5（1）：38-40.