劉 韡 馬 瑞 王艷霞 安瑞芳

1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安 710004；2.陜西省婦幼保健院，陜西西安 710004；3.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安 710061

妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾?。℅TD）主要包括完全性葡萄胎（complete hydatidiform mole，CHM）、部 分 性 葡 萄 胎（partial hydatidiform mole，PHM）、侵蝕性葡萄胎（invasive hydatidiform mole，IHM）和絨毛膜癌（choriocarcinoma，CC）等，另外還包括胎盤部位滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤（placental site trophoblastic tumor，PSTT）和上皮樣滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤（epihtelialrtophoblastieutmor，ETT）等少見類型。除葡萄胎外，又統(tǒng)稱為妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤（gestational trophoblastic neoplasia，GTN），侵蝕性葡萄胎全部來自葡萄胎，而其他滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤可以來自正常或異常妊娠[1]。

妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤是一類嚴(yán)重威脅女性生殖健康的疾病，目前，主要靠動態(tài)觀察血β-HCG 的變化及臨床癥狀、體征來診斷GTN 及預(yù)測起惡變及預(yù)后，但這些臨床特點(diǎn)的出現(xiàn)，具滯后性，甚至延誤治療[2]。因此，尋找新的治療藥物和有效的預(yù)后標(biāo)記物，以及攻克本疾病仍需要不斷進(jìn)一步的研究。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)多種因素參與其發(fā)病過程，比如癌基因、抑癌基因，凋亡因子，抑制凋亡因子等。

凋亡抑制蛋白（Inhibitor of apoptosis proteins，IAP）是一類內(nèi)源性細(xì)胞抑制因子，在很多物種中起抑制凋亡的作用，其過度表達(dá)引起凋亡不足、增殖過度，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。尋找有效的IAP 抑制劑，在腫瘤的治療中有著廣泛的應(yīng)用前景[3-4]。Livin（又稱KIAP，ML-IAP）是最新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)IAP 家族中的成員，因其在腫瘤組織中的特異性高表達(dá)，已經(jīng)成為近期研究的熱點(diǎn)[5-6]。目前研究表明多種凋亡相關(guān)基因參與妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病的發(fā)生、發(fā)展，但Livin 蛋白在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病中的表達(dá)以及相關(guān)性的研究卻鮮有所見。

1 資料與方法

1.1 一般資料

22 例妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者病例均來自1993 年1月～2006 年1 月西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院?；颊呔鶠榕?，年齡最小21 歲，最大53 歲，平均32.6 歲。手術(shù)治療的侵蝕性葡萄胎患者的標(biāo)本14 例，手術(shù)治療的絨癌患者的標(biāo)本8 例。并隨機(jī)選擇正常妊娠（5 ～12 周）行人工流產(chǎn)終止妊娠者的絨毛組織(正常絨毛細(xì)胞組)10 例作為對照。全部病例均經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)。

1.2 主要試劑

兔抗人Livin 多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。兔SABC 檢測試劑盒（SP-9001）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

取上述病例蠟塊切片，厚4μm，采用免疫組織化學(xué)鏈霉親和素生物素過氧化物酶復(fù)合物（SABC）法檢測。陰性對照：以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替第1 抗體；陽性對照：用已知陽性染色切片作陽性對照。

1.4 結(jié)果判定

每張切片選擇有代表性的區(qū)域，并避開切片周邊區(qū)域，觀察陽性反應(yīng)采用雙盲法，并由有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師觀察每張切片后一起做出判斷。以滋養(yǎng)細(xì)胞胞漿或胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，每張切片顯微鏡下隨機(jī)觀察10 個(gè)視野，高倍鏡（×400）下綜合染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行半定量測定。染色強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn)：染色強(qiáng)度以不著色為0 分，淺黃色為1 分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細(xì)胞數(shù)＜5%為0 分，5%～25%為1 分，26% ～50%為2 分，＞50%為3 分。

染色強(qiáng)度×陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)為每例組織染色的綜合記分。0 ～1 分為陰性（-），2 ～3 分為弱陽性（+），4 ～6 分為陽性（++），＞6 分為強(qiáng)陽性（+++）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用四格表Fisher’s 確切概率法和Spearman 等級相關(guān)分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Livin在GTN組織中的表達(dá)

在正常絨毛組織、GTN 中，Livin 的表達(dá)主要定位于合體滋養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞核中，部分定位于細(xì)胞漿中。 細(xì)胞核棕黃色或棕褐色為陽性細(xì)胞，呈均勻染色狀。正常絨毛組織、GTN 中Livin 的表達(dá)情況見圖2 ～4。

表1，圖1 結(jié)果可見，Livin 在正常絨毛組織和GTN組織中均有所表達(dá)，在侵蝕性葡萄胎、絨癌組織中表達(dá)明顯，陽性率分別為100%（20/20）、57.1%（8/14）和87.5%（7/8），正常組織與GTN 組織中Livin 的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=20.391，P ＜0.05）;利用Fisher確切概率法在四組之間進(jìn)行兩兩比較發(fā)現(xiàn)，Livin 在侵葡和絨癌組織中的表達(dá)顯著高于正常絨毛組織，差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。

表1 Livin在正常絨毛和GTN組織中的表達(dá)

圖1 Livin 在正常絨毛和GTD 組織中的表達(dá)情況

2.2 Livin在GTN中的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

由表2 結(jié)果可見，Livin 在22 例GTN 組織中的表達(dá)率為68.2%，Livin 在GTN 中的表達(dá)與臨床分期具有相關(guān)性（P ＜0.05），且Ⅱ期＞Ⅰ期＞Ⅲ期，Livin 與GTN 患者的年齡、前次妊娠是否為葡萄胎、治療前HCG 值的高低、是否有轉(zhuǎn)移及預(yù)后無明顯相關(guān)性（P ＞0.05）。

表2 Livin 在GTN中的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

近十年來，妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病的分子生物學(xué)研究取得很大的發(fā)展，眾多學(xué)者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種腫瘤標(biāo)志物，與GTN 的發(fā)病發(fā)展有關(guān)，包括：白介素、腫瘤壞死因子、血管內(nèi)皮生長因子、增殖性標(biāo)志物中的PCNA、Ki-67、金屬蛋白酶及其抑制物以及癌基因、抑癌基因等[7]。

圖1 Livin 在正常絨毛中的陽性表達(dá)（×400）

圖2 Livin 在侵葡中的陽性表達(dá)（×400）

圖3 Livin 在絨癌中的陽性表達(dá)（×400）

3 討論

研究表明，細(xì)胞凋亡(即細(xì)胞程序性死亡)的程序失去控制在腫瘤形成過程中有十分重要的作用[8]。參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的基因就有可能參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，主要與三個(gè)基因家族即Bcl-2 家族、caspase 家族和凋亡抑制蛋白（Inhibitoror of apoptosis，IAP）家族關(guān)系密切[9-10]。

IAP 是一類內(nèi)源性細(xì)胞抑制因子，其過度表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡與腫瘤發(fā)生關(guān)系密切。Livin 作為一種新發(fā)現(xiàn)的IAP 家族成員，其具有的特異性BIR 和RING 指結(jié)構(gòu)域，可以通過多種途徑發(fā)揮抑制細(xì)胞調(diào)亡作用，主要是通過抑制Caspase 蛋白的級聯(lián)激活反應(yīng)來抑制凋亡過程[11-12]。目前，國內(nèi)外文獻(xiàn)中Livin 在GTD 中表達(dá)情況的鮮有報(bào)道。有相關(guān)研究表明，凋亡相關(guān)因子與葡萄胎的惡變相關(guān)，可能與滋養(yǎng)細(xì)胞低凋亡活性有關(guān)[13]。我們的研究結(jié)果顯示Livin 在GTD 組織中，表達(dá)于細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞和合體滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞核中，少部分表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中，這與其他文獻(xiàn)中的報(bào)道一致，但是我們無法解釋為什么Livin 主要表達(dá)在細(xì)胞核中，而不是細(xì)胞質(zhì)中，有可能是因?yàn)長ivin 有兩種不同形式的存在方式Livin α 和Livin β，這兩種分子有不同的生物學(xué)特性及組織分布類型，但是它們都在凋亡信號啟動后有著抑制凋亡的作用，兩者起著相互協(xié)調(diào)的作用[14-17]。而在我們的試驗(yàn)中，單純用免疫組織化學(xué)法是無法區(qū)分出到底是兩者中的哪個(gè)起著主要作用，這有待于在將來的研究中找出兩者在細(xì)胞中的不同的定位。

本實(shí)驗(yàn)表明，Livin 蛋白在GTN 中的表達(dá)與患者的年齡、前次妊娠是否為葡萄胎、治療前HCG 的水平、有無轉(zhuǎn)移、及預(yù)后無明顯相關(guān)性，但Livin 與GTN 組織臨床分期有明顯相關(guān)性，說明Livin 蛋白的表達(dá)可能與GTN 的臨床分期有關(guān)，但Livin 在GTN 中的表達(dá)Ⅱ期＞Ⅰ期＞Ⅲ期，卻不是明顯的正相關(guān)或負(fù)相關(guān)。因此本實(shí)驗(yàn)提示Livin 參與了GTD 的發(fā)病，并且與腫瘤的臨床分期有關(guān)，但與其他研究中不同的是Livin 蛋白的表達(dá)與腫瘤的多項(xiàng)臨床特征的相關(guān)性不明顯，這有可能是因?yàn)椴煌[瘤的發(fā)生機(jī)制不同，組織結(jié)構(gòu)也不同，所以研究的結(jié)果也不盡相同，但也有可能與本實(shí)驗(yàn)樣本量較少有關(guān)，這可以在以后的研究中進(jìn)一步探討。但是Livin 蛋白在GTD 中的高表達(dá)，以及抗凋亡作用的增強(qiáng)，還是可以說明，Livin 蛋白有可能作為GTD 診斷、預(yù)后不良的一個(gè)參考指標(biāo)之一。

綜上所述，Livin 在妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤中的高表達(dá)，提示可能參與了妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，為臨床診斷及治療尋找新的作用靶點(diǎn)。

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