■郭曉明 陸圣杰 王佳亮 許甲平朱 賢 鄧志剛

（1.上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，上海 201418;2.上海德邦牧業(yè)有限公司，上海 201108）

相對于無機鹽形式的微量元素而言，氨基酸螯合物可以大幅度提高動物對微量元素的吸收利用率，同時具有殺菌、促酶活等功能，因此，近年來已經(jīng)成為飼料添加劑的重要組成部分[1]。甘氨酸亞鐵能夠提高動物體內(nèi)的血紅素含量和轉(zhuǎn)鐵蛋白的含量，對動物的缺鐵性貧血具有很好的預(yù)防和治療作用。近期的研究還表明，甘氨酸亞鐵能顯著改善仔豬的生長性能[2]，提高蛋雞的產(chǎn)蛋率和改善蛋品質(zhì)[3]。因此，在眾多的氨基酸微量元素螯合物中，甘氨酸亞鐵的研究和使用最為廣泛。

甘氨酸亞鐵產(chǎn)品中游離甘氨酸（未螯合的甘氨酸）的含量能體現(xiàn)生產(chǎn)過程中甘氨酸與亞鐵離子的螯合率，在一定的前提條件下也能反映甘氨酸亞鐵的穩(wěn)定性，是評價生產(chǎn)工藝和產(chǎn)品性能的一項重要指標(biāo)。當(dāng)前國標(biāo)(GB/T 21996—2008)有關(guān)甘氨酸亞鐵產(chǎn)品中游離甘氨酸的測定采用非水滴定法。然而，化驗人員普遍反映在測試過程中存在滴定終點快速返色導(dǎo)致無法準(zhǔn)確判斷終點的問題。

本文簡單介紹了非水滴定原理，分析了國標(biāo)(GB/T 21996—2008)所制定方法中存在的問題，在此基礎(chǔ)上，提出了可行的改進(jìn)方法，并用實驗進(jìn)行了驗證。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

循環(huán)水式真空泵（河南鞏義予華儀器廠），恒溫水浴槽（HHS-21，上海博迅醫(yī)療設(shè)備有限公司），電子天平（BS224S，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），量程為50 ml的酸式滴定管和量程為5 ml的微量滴定管（上海申玻儀器公司）。高氯酸、冰醋酸、醋酸酐、鄰苯二甲酸氫鉀、甘氨酸均購自國藥集團化學(xué)試劑公司，高氯酸是濃度為70%的水溶液，其它試劑為分析純；結(jié)晶紫指示劑按照國標(biāo)GB/T 603的方法配制，濃度為0.5 g/l，甘氨酸亞鐵（甘氨酸與亞鐵離子的摩爾比為1∶1）由作者實驗室自行制備。

1.2 實驗方法

1.2.1 高氯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制與標(biāo)定

1.2.1.1 溶液的配制

量取0.7～0.9 ml濃度為70%的高氯酸與500 ml冰醋酸混合均勻，加入30 ml醋酸酐搖振，使其充分混合，再用冰醋酸稀釋至1 000 ml。靜置過夜，使醋酸酐與水充分反應(yīng)，此溶液貯藏于棕色瓶中，臨用前標(biāo)定。

1.2.1.2 溶液的標(biāo)定

精確稱取鄰苯二甲酸氫鉀（110℃恒重）約0.5 g，溶于50 ml冰醋酸中，加入結(jié)晶紫指示劑4～5滴，用高氯酸的冰醋酸溶液滴定至藍(lán)綠色。

1.2.2 甘氨酸與甘氨酸亞鐵在冰醋酸中的溶解度測定

在燒杯中加入100 ml冰醋酸并置于溫度為25℃的恒溫水浴槽中。稱取一定質(zhì)量的甘氨酸于稱量瓶中，分多次從中移取適量甘氨酸至冰醋酸中，攪拌，直至有不溶物出現(xiàn)為止，稱量剩余甘氨酸質(zhì)量，用減量法求出冰醋酸中已溶解的甘氨酸質(zhì)量。計算出25℃下，甘氨酸在冰醋酸中的溶解度。采用相同的方法測定甘氨酸亞鐵在冰醋酸中的溶解度。

1.2.3 甘氨酸亞鐵中游離甘氨酸的分離

稱取0.5 g甘氨酸亞鐵樣品溶于一定量的冰醋酸中，攪拌5 min，再浸漬10 min，減壓過濾，用少量冰醋酸洗滌濾餅，濾液用于滴定分析。

1.2.4 游離甘氨酸的測定

1.2.4.1 未預(yù)先分離游離甘氨酸（國標(biāo)GB/T 21996—2008的方法）：稱取0.5 g甘氨酸亞鐵（精準(zhǔn)至0.000 2 g），置于250 ml錐形瓶中，加入30 ml冰醋酸，攪拌5 min，再浸漬10 min，加入4～5滴結(jié)晶紫指示劑，溶液此時顯紫紅色。用高氯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，溶液由紫紅色變?yōu)樗{(lán)綠色為滴定終點。同時做空白實驗。

1.2.4.2 預(yù)先分離游離甘氨酸：先按1.2.3所述方法分離甘氨酸亞鐵樣品中的游離甘氨酸，在濾液中加入指示劑，用高氯酸滴定。

2 結(jié)果與討論

2.1 非水滴定法測定氨基酸簡介（以甘氨酸為例）

氨基酸分子中含有-NH2和-COOH，為一兩性物質(zhì)。在水中，甘氨酸的酸性(羧基上的氫Ka=2.5×10-10)和堿性(氨基作為堿的Kb=2.2×10-12)都很弱，無法用酸堿滴定法準(zhǔn)確滴定[4]。根據(jù)酸堿理論中的區(qū)分效應(yīng)原理，甘氨酸在非水介質(zhì)冰醋酸中相當(dāng)于一種強堿，用HClO4(在冰醋酸中也顯強酸性)作滴定劑，可實現(xiàn)甘氨酸的準(zhǔn)確滴定。該方法屬于酸堿滴定范疇，滴定反應(yīng)式如下：

滴定采用結(jié)晶紫作指示劑，當(dāng)pH值大于3.0時指示劑顯紫色，當(dāng)pH值小于等于2.0時顯藍(lán)綠色。高氯酸滴定冰醋酸中的甘氨酸時，滴定終點的顏色由紫紅色變?yōu)樗{(lán)綠色。

2.2 國標(biāo)法測定游離甘氨酸過程中指示劑返色的原因

作者按國標(biāo)GB/T 21996—2008的方法對甘氨酸亞鐵中的游離甘氨酸進(jìn)行了測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，滴定終點極易發(fā)生返色現(xiàn)象（約1～2 s即返色，隨著滴定繼續(xù)進(jìn)行返色時間逐步延長），導(dǎo)致難以判斷滴定終點。同時，作者發(fā)現(xiàn)滴定過程中的滴定速度、錐形瓶的搖蕩幅度和搖蕩頻率也對指示劑變色點的出現(xiàn)有很大影響。這與眾多生產(chǎn)和使用甘氨酸亞鐵的實驗室化驗人員反映的情況一致。

就固體狀態(tài)的甘氨酸亞鐵產(chǎn)品而言，游離甘氨酸即未與金屬離子發(fā)生螯合的那部分甘氨酸，這是控制生產(chǎn)工藝和評價產(chǎn)品性能的重要指標(biāo)，也是檢測的目標(biāo)物。然而，當(dāng)把甘氨酸亞鐵產(chǎn)品加入到冰醋酸中時，甘氨酸亞鐵存在解離平衡，如反應(yīng)②所示：

此時，游離甘氨酸包括兩部分，一是產(chǎn)品中未發(fā)生螯合反應(yīng)的甘氨酸，二是在醋酸中解離出來的甘氨酸。當(dāng)?shù)稳敫呗人釙r，兩部分游離甘氨酸都與高氯酸結(jié)合生成高氯酸鹽（如反應(yīng)①所示），過量的高氯酸使結(jié)晶紫由紫紅色變?yōu)樗{(lán)綠色。但是，滴定過程中甘氨酸濃度的降低打破了反應(yīng)②的平衡，甘氨酸亞鐵會進(jìn)一步解離產(chǎn)生游離甘氨酸，即反應(yīng)②的平衡向右移動。平衡移動產(chǎn)生的游離甘氨酸又與高氯酸結(jié)合，導(dǎo)致指示劑重新由藍(lán)綠色變?yōu)樽霞t色，即滴定終點返色。由于在滴定過程中反應(yīng)②的平衡移動速度較快，在滴定速度較慢的情況下，滴定終點嚴(yán)重滯后。此時，高氯酸不僅滴定了產(chǎn)品中未發(fā)生螯合反應(yīng)的甘氨酸，也滴定了已發(fā)生螯合的部分甘氨酸。

由以上分析可知，采用非水滴定方法測定甘氨酸亞鐵產(chǎn)品中的游離甘氨酸時，應(yīng)先將游離甘氨酸從產(chǎn)品中分離出來。

2.3 甘氨酸亞鐵和游離甘氨酸的分離

從氨基酸螯合物產(chǎn)品中分離出游離氨基酸通常有凝膠過濾色譜法[5]和離子交換法[6]。這些方法操作繁瑣，條件控制要求高，且后續(xù)的檢測通常需要大型儀器。本文利用甘氨酸和甘氨酸亞鐵的溶解度的差異來實現(xiàn)兩者的分離。

由于甘氨酸亞鐵和甘氨酸均易溶于水[7]，且后續(xù)滴定是非水環(huán)境，因此首先排除水作分離溶劑的可能。甘氨酸亞鐵和甘氨酸在甲醇、乙醇中的溶解度均很小[8]，因此也不可采用醇類作分離溶劑。按照1.2.2的步驟，作者測定了25℃時甘氨酸和甘氨酸亞鐵在醋酸中的溶解度。結(jié)果顯示，甘氨酸的溶解度為440 mg/100 ml醋酸，而甘氨酸亞鐵的溶解度小于2 mg/100 ml醋酸。由于兩者的溶解度差異很大，可以通過溶解過濾的簡單辦法實現(xiàn)兩者的分離，具體過程如1.2.3所述。作者認(rèn)為，甘氨酸之所以在醋酸中有較大的溶解度是因為甘氨酸的羧基和氨基均可與醋酸分子之間形成氫鍵，而甘氨酸亞鐵中相應(yīng)的基團已和亞鐵離子發(fā)生了配位，消弱了和醋酸形成氫鍵的能力。

2.4 樣品分析

采用冰醋酸作溶劑分離游離甘氨酸與甘氨酸亞鐵，然后滴定溶解于冰醋酸中的甘氨酸，結(jié)果如表1所示。滴定終點沒有返色現(xiàn)象，且滴定過程中滴定速度對滴定終點沒有影響。測試結(jié)果的RSD為3.7%，表明該方法的測試精密度較好。在甘氨酸亞鐵產(chǎn)品中加入1.00、1.50和5.00 mg/g的分析純甘氨酸按此改進(jìn)后的方法進(jìn)行加標(biāo)回收實驗，回收率為95.4%～102.8%(見表2)，表明該方法的準(zhǔn)確度也較好。該方法能夠滿足實際樣品分析檢測的要求。

表1 甘氨酸亞鐵產(chǎn)品中游離甘氨酸的測試結(jié)果

表2 加標(biāo)回收實驗結(jié)果

表1還給出了未預(yù)先分離情況下樣品的測試數(shù)據(jù)（滴定速度為每秒1～2滴，指示劑30 s內(nèi)不返色為終點），游離甘氨酸的平均值為4.55 mg/g，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為10.1%。與預(yù)先分離測試結(jié)果相比，游離甘氨酸的測定值顯著偏大。這是因為在未預(yù)先分離游離甘氨酸的情況下，高氯酸不僅滴定了產(chǎn)品中未發(fā)生螯合反應(yīng)的甘氨酸，也滴定了已發(fā)生螯合的部分甘氨酸，造成了很大的系統(tǒng)正誤差。測試結(jié)果的精密度下降則是由于滴定終點存在返色現(xiàn)象使終點的判斷不精確所致。顯然，不預(yù)先分離甘氨酸亞鐵中的游離甘氨酸直接進(jìn)行非水滴定的測試方法無法達(dá)到檢測目的，不能滿足分析檢測要求。

3 小結(jié)

采用非水滴定方法測定甘氨酸亞鐵產(chǎn)品中游離甘氨酸的含量，必須先把游離甘氨酸與甘氨酸亞鐵分離。否則，測試結(jié)果存在很大的系統(tǒng)正誤差且精密度低，不能滿足分析檢測要求。利用游離甘氨酸和甘氨酸亞鐵在冰醋酸中的溶解度差異可以實現(xiàn)兩者的分離。采用非水滴定方法對預(yù)分離后的游離氨基酸進(jìn)行了測定，RSD為3.7%，表明測試精密度較高；對甘氨酸亞鐵產(chǎn)品進(jìn)行了加標(biāo)回收實驗，回收率為95.4%～102.8%，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。改進(jìn)后的方法能夠滿足實際樣品分析檢測的要求，且有望用于其它氨基酸螯合物中游離氨基酸的測定。