■王海燕 湯海鷗 王曉睿 楊祿良 劉 影

（1.北京挑戰(zhàn)生物技術有限公司，北京 100081；2.生物飼料開發(fā)國家工程研究中心，北京 100081）

隨著畜牧業(yè)的發(fā)展和生產水平的提高，植酸酶在飼料工業(yè)中的應用越來越廣泛。植酸酶即肌醇六磷酸磷酸水解酶，催化植酸水解生成低級肌醇磷酸衍生物和無機磷酸，可有效提高植物性飼料中磷的利用率，增加可利用養(yǎng)分的數(shù)量，可以定量地替代無機磷飼料。由于植酸酶催化效率高，很小的添加量就能替代幾十倍至百倍以上的磷酸氫鈣或骨粉，為飼料配方設計節(jié)省出了寶貴的空間，降低飼料成本，提高飼料消化率，改善動物的生產性能，減輕畜禽排放磷對環(huán)境的污染，其添加效果日益得到各方面的認可。

植酸酶應用大多以干粉粒的形式在飼料加工調質和制粒之前添加，而酶在制粒的過程中所處的環(huán)境是高溫蒸汽，活力損失較大。目前，制備耐高溫植酸酶的主要方法有：①篩選能夠產耐高溫植酸酶的微生物基因(自然基因或者改造基因)及其相應的生產菌種；②采用包被、微囊化等劑型技術提高耐溫性[1-2]。前者是酶蛋白分子本身具有較高的熱穩(wěn)定性，故效果最佳，而后者因為成本、包材影響釋放等原因在實際使用中存在一些弊端。這兩種類型的耐高溫植酸酶都在市場上有售，因為沒有統(tǒng)一的、公認的評判標準，各家產品的熱穩(wěn)定性也是眾說紛紜。本文綜合目前評估植酸酶熱穩(wěn)定性的方法[3-5]及我們的實際檢測情況作一介紹，以便為植酸酶的熱穩(wěn)定性評估提供參考依據(jù)。

1 實驗室評估植酸酶熱穩(wěn)定性的方法

1.1 水浴法

按照國標法操作，將固體植酸酶溶解釋放到緩沖液中，取一定體積一定稀釋濃度的溶液到玻璃試管中，將玻璃試管放到已經達到目的溫度的水浴鍋中保溫一定時間后測定酶活力[5]。該方法是通過調節(jié)水浴鍋中水溫和水浴時間來反映溫度對植酸酶活性的影響，方法簡單、操作方便。在水浴處理過程中，酶蛋白分子是完全暴露在高溫的水環(huán)境中，與實際制粒條件差別很大，當體系中含有大量的自由水時，就會破壞酶分子內部的氫鍵，而氫鍵在維持酶的空間構象中起著重要的作用，因此酶分子構象容易發(fā)生變化，酶就易于變性失活。

水浴法評估植酸酶熱穩(wěn)定性時要注意兩個問題：一是水浴法適合于評估酶蛋白分子本身具有熱穩(wěn)定性的植酸酶產品，不適合于評估包被型植酸酶的耐熱性。水浴法將植酸酶溶解釋放出來實際上就是去除了包被材料的保護作用，無法反映出后處理工藝對熱穩(wěn)定性的影響。二是熱處理時酶液濃度對保存率有影響。在固體酶的溶解釋放過程中，釋放出的不僅有酶蛋白分子，還有其他離子，稀釋倍數(shù)不同則這些離子的濃度也不同，因而離子強度不同。蛋白質所處環(huán)境中的離子強度能夠影響其空間結構，功能與結構密切相關。為了驗證此觀點，進行了以下試驗論證。

取0.208 6 g植酸酶樣品，溶于約80 ml緩沖液中，25 ℃、250 r/min震蕩30 min，定容至 100 ml，取一定體積的溶液于4 000 r/min離心10 min，取上清得原酶液，分別測定原酶液、原酶液80℃保溫3 min、原酶液稀釋至 1/50再80℃保溫3 min的酶活力，結果見表1。

表1 不同熱處理濃度對酶活保存率的影響

從上面試驗結果可以看出，同一個樣品，熱處理時不同的酶溶液濃度可導致不同的保存率。因此面對不同來源的數(shù)據(jù)，比較不同產品的保存率時一定要慎重。

在實際采用植酸酶國標GB/T 18634—2009進行測定過程中，我們一般認為實測吸光值A-A0在0.2～0.5范圍內數(shù)據(jù)為可采用數(shù)據(jù)。若超出此范圍，則需相應地調整稀釋倍數(shù)，重新測定，即調整試樣溶液的濃度在0.4 U/ml左右。因此在進行熱評估過程中，我們統(tǒng)一熱處理的濃度為測定濃度的10倍，即試樣溶液的濃度在4 U/ml左右，對多數(shù)植酸酶產品而言，如果保存率不低于10%即可適當?shù)南♂屵M行酶活測定。

1.2 干熱法

干熱法是將植酸酶樣品在恒溫干燥箱里直接處理一定時間，然后測定植酸酶保存的活性[6]。通常酶在非常干燥的情況下，構象比較穩(wěn)定，具有一定的耐熱性。因干熱法的條件與實際制粒條件差異太大，又不像水浴法那樣將酶蛋白分子置于苛刻的條件下反映出酶本身的熱穩(wěn)定性，用干熱法得到的酶的保存率都偏高，參考意義較小，因此實際中應用得相對較少。

1.3 濕熱法

濕熱法即模擬制粒法，是干熱法基礎上進一步考慮調質和制粒時濕度因素，使得在方法學上實驗室評價調質和制粒加工對植酸酶活性的影響更接近實際調質和制粒條件[6]。顆粒飼料制粒過程中酶制劑經歷的是高溫、高濕和高壓的環(huán)境，濕熱法模擬的是高溫、高濕的條件。

本實驗室的具體操作是：①測玉米面實際含水率；②取一定量植酸酶與玉米面混合均勻，調水分到16%。植酸酶因比例小水分可忽略；③將上述混合物放入已達目的溫度的干燥箱中，保溫一定時間后取出自然冷卻至室溫；④測酶活力。在實際操作過程中，步驟②因手工操作很難混合均勻，取樣檢測濕熱處理前的酶活時變異系數(shù)很大。雖然可以根據(jù)植酸酶與玉米面的混合比例計算出混合物中植酸酶的理論酶活，但我們的經驗是理論值和實測值是有差異的。為了解決混合不均勻對試驗結果的影響，我們采取的措施是步驟②精確平行稱量兩份植酸酶樣品分別與玉米面混合，一份全部混合物用于測定濕熱處理前的酶活力，另一份熱處理后全部抽提測定酶活力。通過這一具體操作上的調整，較好地解決了因混合不均勻導致的結果變異大的問題。

實踐證明，經干熱法和濕熱法評估得到的耐高溫植酸酶的保存率均比水浴法和實際制粒法的高，本實驗室中通常采用水浴法快速評估植酸酶的熱穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)經75℃、5 min或80℃、5 min熱處理后，不同廠家的耐高溫植酸酶保存率差別比較大，建議有評估條件的用戶首先用水浴法對裸酶耐高溫的植酸酶產品（即非包被的耐高溫植酸酶）進行初步篩選評估。

2 實際制粒條件下評估植酸酶熱穩(wěn)定性

無論水浴法、干熱法還是濕熱法來評估耐高溫植酸酶的熱穩(wěn)定性都只能作為參考，植酸酶能否耐受制粒的條件、制粒后酶活保存率能達到多少，最具有說服力的就是實際制粒后測定的結果。實際制粒評估植酸酶熱穩(wěn)定性存在兩個問題：一是植酸酶在配合飼料中的含量太低，誤差對結果影響大；二是植酸酶因添加量小混合均勻度的問題難以解決。

植酸酶實際使用中的理論含量一般是400～500 U/kg配合飼料，而植酸酶國標法的檢出下限是130 U/kg。酶活太低則測定時吸光值很低，落在了國標法標準曲線中濃度與吸光值成線性關系的范圍外，檢測值無法準確地反映實際值。為解決這個問題，我們將國標法標準溶液濃度稀釋10倍做適用于配合飼料的標準曲線，將取樣量加大到5 g定容到100 ml緩沖液中。即使這樣，結果依然不理想，試驗誤差對檢測結果的影響所占比例大?，F(xiàn)在市場上的耐高溫植酸酶常見劑型為顆粒型，添加量小，即使采用逐級稀釋也很難避免混合不均勻的問題，即使混合均勻了，因測量取樣量少而加大了數(shù)據(jù)變異。下面以本實驗室檢測的一組樣品的原始數(shù)據(jù)來說明這個問題，見表2。

表2 加酶飼料的檢測原始數(shù)據(jù)

樣品A3T檢測了4次，得出的4個酶活力差別很大。類似的情況多次出現(xiàn)在正常添加劑量的加酶飼料樣品中。國標法中對重復性的描述是：同一試樣兩個平行測定值的相對偏差，添加植酸酶的各種飼料樣品不大于15%。相對偏差=（個別測定值-算數(shù)平均值）/算數(shù)平均值，表2的連續(xù)2 d的2次平行測定，相對偏差分別達到了47.46%和100%。用這樣的數(shù)據(jù)來評判制粒效果結果是不可信的。

為了解決加酶飼料酶活力測定誤差影響大和混合不均勻的問題，我們設計的制粒實驗方案是加大植酸酶的用量，一般是正常用量的10～20倍，各取調質后制粒前粉狀飼料和制粒后顆粒飼料樣品5個平行樣，按照國標法檢測植酸酶活力，如果相對偏差不大于15%，說明檢測數(shù)據(jù)是可以采用的，結果分別取平均數(shù)。對于相對偏差大于15%的數(shù)據(jù)進行舍棄后再取平均數(shù)。這個實驗方案能在一定程度上提高試驗結果的可信性，但是也經常會出現(xiàn)數(shù)據(jù)差別大的情況。下面我們用實際檢測情況為例說明這個問題。本次制粒實驗植酸酶檢測酶活為9 015 U/g，添加量是1.2 kg/500 kg飼料，則制粒前加酶飼料酶活力理論值是21.636 U/g，制粒前和制粒后檢測結果見表3。

表3 制粒實驗加酶飼料檢測結果

制粒前加酶飼料的5個測定值的相對偏差均小于15%，酶活力平均值為18.112 U/g，根據(jù)植酸酶樣品酶活力和添加量換算出來的酶活力理論值是21.636 U/g，說明飼料中的一些成分對測定結果有影響。制粒后5個測定值的平均數(shù)是13.08 U/g，制粒保存率為72.22%，制粒后樣品1酶活力10.46 U/g和制粒后樣品5酶活力15.09 U/g相對偏差分別是20%和15.4%，舍棄后平均值為13.28 U/g，制粒保存率為73.33%。制粒后樣品5相對偏差15.4%，剛超出國標規(guī)定，如果數(shù)據(jù)采用，則制粒后酶活力平均值為13.74 U/g，制粒保存率為75.86%。因為數(shù)據(jù)的采用情況不同，制粒后酶活保存率可以為72.22%、73.33%或者75.86%，但是總體來說，保存率差別不是很大。本次制粒實驗較好地反映出了制粒后酶活力的保存情況。

在上述制粒實驗中，還有一個現(xiàn)象值得注意，飼料調制和制粒前的粉狀飼料檢測結果相對偏差均小于15%，說明植酸酶混合的均勻度比較好，然而制粒后檢測有兩個結果偏差大于15%，推測這種變化不僅僅是由混合均勻度導致，可能與制粒過程中調制機內部溫濕度及壓力不均勻有關。

影響實驗結果的因素很多，如果考慮不全面很可能導致實驗的失敗。目前耐高溫植酸酶用戶最關心的問題是植酸酶制粒后能保存多少酶活，能否滿足動物生產中的需要。不同飼料廠由于設備、飼料配方、加工工藝等的差異，飼料制粒過程中的調質溫度、調制時間、蒸汽壓力、環(huán)?？讖降葏?shù)有較大的差異。對于某一種植酸酶的耐熱性評價，需要針對不同的飼料調質、制粒參數(shù)，在濕熱蒸汽處理時間上要做出適當調整，使評估方法更接近于特定飼料廠生產的實際。但是評估也并非取樣測定一下這么簡單，實驗設計是否合理，取樣是否合理，取樣的數(shù)量是否足夠具有代表性等等，很多因素會影響到結果是否能真實地反映出植酸酶的制粒效果。

有研究表明，植酸酶能夠提高蛋白質、氨基酸、能量、礦物質的利用率[7]，高劑量植酸酶顯著提高肉雞的生長性能以及表觀代謝能(AME)、蛋白質、氨基酸、鈣、磷的消化率。有研究表明，高劑量添加植酸酶（8 000 FTU/kg）不會對動物造成不良影響[8]。因此，考慮到正常添加量在實際檢測中誤差影響太大，建議客戶在通過實際制粒評估植酸酶熱穩(wěn)定性時，加大植酸酶的劑量，一方面可以提高評估實驗本身的科學性和可信度；另一方面，用于評估的飼料可以正常的使用，不會造成浪費或不良后果。

3 小結

通過實驗，我們建議耐高溫植酸酶熱穩(wěn)定性評估的方法為：

①實驗室評估。水浴法，將酶溶液濃度調整到4 U/ml左右，在一定溫度的水浴中保溫一定時間后測酶活力。保存率（%）=熱處理后的酶活/原酶活×100。②制粒評估。制粒時植酸酶添加到正常用量的10～20倍，各取調質后制粒前粉狀飼料和制粒后顆粒飼料樣品5個平行樣進行測定。將國標法標準溶液濃度稀釋10倍做適用于加酶飼料的標準曲線，按照國標法檢測植酸酶活力。植酸酶保存率（%）=顆粒料植酸酶活力/粉料植酸酶活力×100。