■楊小佳 王金水 藺丹華 周 揚(yáng) 楊 森

（1.河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南鄭州 450001；2.河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南鄭州 450001)

相對(duì)于花生粕、菜籽粕及棉籽粕等植物蛋白，豆粕蛋白質(zhì)含量較高，且含有豐富的賴氨酸、蛋氨酸等限制性必需氨基酸，能夠滿足一般動(dòng)物對(duì)蛋白質(zhì)的需求，是最佳的植物蛋白原料。但豆粕中存在的一些抗?fàn)I養(yǎng)因子，如胰蛋白酶抑制劑、大豆凝集素與抗原蛋白等，影響動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收[1-2]，降低了豆粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值；而且大豆蛋白結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，動(dòng)物不易消化吸收。而利用微生物發(fā)酵處理的豆粕，大豆蛋白被微生物分泌的蛋白酶酶解，抗?fàn)I養(yǎng)因子被消除[3]，提高了豆粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,動(dòng)物試驗(yàn)表明發(fā)酵豆粕可以促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)[4]。而且酶解過(guò)程生成了低分子的肽類物質(zhì)，這些分子量在5 000 u以下的肽類物質(zhì)具有抗氧化性[5-6]、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫[7]等生物活性，而且提高了蛋白質(zhì)的消化率[8]，是理想的蛋白原料，在飼料工業(yè)領(lǐng)域具有廣泛的用途。

但目前富肽蛋白原料的生產(chǎn)多集中于利用蛋白酶酶解大豆蛋白，其成本較高，且產(chǎn)生大量廢水，而利用固態(tài)發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)富肽蛋白原料，將傳統(tǒng)的固態(tài)發(fā)酵技術(shù)與現(xiàn)代生物技術(shù)結(jié)合，具有成本低，綠色節(jié)能的特點(diǎn)。富肽蛋白的固態(tài)發(fā)酵過(guò)程可以分為兩個(gè)階段：①微生物的生長(zhǎng)及蛋白酶的分泌；②蛋白酶酶解大豆蛋白，生成低分子的肽類物質(zhì)。而且微生物產(chǎn)酶的最適溫度與蛋白酶酶解最適溫度不同[9]，因此通過(guò)變溫發(fā)酵可以提高蛋白酶的酶解速率，產(chǎn)生更多的肽類物質(zhì)。本文將研究淺盤式反應(yīng)器制備富肽蛋白時(shí)發(fā)酵因素對(duì)蛋白酶產(chǎn)率的影響，利用響應(yīng)曲面法（RSM），以發(fā)酵豆粕蛋白酶酶活力為指標(biāo)，對(duì)發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、層厚度與基質(zhì)含水量幾個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，尋求最優(yōu)的產(chǎn)酶條件，然后以變溫發(fā)酵制備富肽蛋白，為固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)富肽蛋白提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

豆粕：河南陽(yáng)光油脂集團(tuán)提供。

枯草芽孢桿菌：BS-GA15，潤(rùn)盈生物工程（上海）有限公司提供。

淺盤式反應(yīng)器設(shè)計(jì)尺寸：底盤直徑10 cm，高度5 cm，底盤網(wǎng)格直徑1 mm。

種子培養(yǎng)基：牛肉膏0.3 g、蛋白胨1.0 g、NaCl 0.5 g，溶解于100 ml水中，調(diào)節(jié)pH值至7.2～7.4，121℃滅菌20 min。

1.2 方法

發(fā)酵豆粕蛋白酶酶活測(cè)定：采用SBT 10317—1999蛋白酶活力測(cè)定法。

發(fā)酵豆粕粗蛋白測(cè)定：采用GB/T 6432—94飼料中粗蛋白測(cè)定方法。

發(fā)酵豆粕酸溶蛋白測(cè)定：采用GB/T 22492—2008大豆肽粉中酸溶蛋白含量測(cè)定方法。

試驗(yàn)方法：取活化的枯草芽孢桿菌一環(huán)，接種于盛有100 ml種子培養(yǎng)基的500 ml錐形瓶中，在恒溫培養(yǎng)箱中30℃，200 r/min培養(yǎng)8 h，然后接種于豆粕培養(yǎng)基中，接種量為10 g（豆粕）/ml（種子液），按試驗(yàn)設(shè)計(jì)調(diào)節(jié)各樣品的含水量、層厚度，在設(shè)定好的溫度與時(shí)間下發(fā)酵。

恒溫發(fā)酵：發(fā)酵溫度30℃、層厚度1.75 cm、基質(zhì)含水量44%，每12 h取樣1次，發(fā)酵72 h。

變溫發(fā)酵：初始發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度30℃、層厚度1.75 cm、基質(zhì)含水量44%，發(fā)酵44 h后發(fā)酵溫度轉(zhuǎn)變?yōu)?0℃，每12 h取樣1次，發(fā)酵72 h。

試驗(yàn)設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)分析：由前期單因素影響試驗(yàn)可知，發(fā)酵溫度30℃、層厚度2.0 cm、基質(zhì)含水量40%及發(fā)酵時(shí)間42 h時(shí)發(fā)酵豆粕中的蛋白酶活力最高，從而確定發(fā)酵溫度、層厚度、基質(zhì)含水量及發(fā)酵時(shí)間4個(gè)因素為優(yōu)化對(duì)象（自變量）。試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用Box-Behnken模型，4個(gè)因素優(yōu)化因素依次以X1、X2、X3、X4表示，以方程 Xi=(xi-x0)/△x對(duì)自變量編碼，方程式中Xi為自變量的編碼值，xi為自變量的真實(shí)值，x0為試驗(yàn)中心點(diǎn)處自變量的真實(shí)值，△x為自變量的變化步長(zhǎng)，因子編碼及各自變量水平見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)因素水平及編碼

統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SAS 9.1.3統(tǒng)計(jì)軟件處理，該回歸模型的擬合曲線可有二次多項(xiàng)式方程表達(dá)：Y=

式中，Y為蛋白酶活力（響應(yīng)值）；A0為常數(shù)項(xiàng)；Ai為線性系數(shù)；Aii為二次項(xiàng)系數(shù)；Aij為交叉項(xiàng)系數(shù)；Xi、Xj為自變量編碼。為求方程中的系數(shù)，共設(shè)定27組試驗(yàn)，其中24個(gè)為析因點(diǎn)，3個(gè)為中心點(diǎn)（3次平行試驗(yàn)，以估算誤差），其試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

2 結(jié)果與討論

2.1 響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn)

利用SAS 9.1.3統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)表2的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面回歸擬合處理，其回歸模型方差分析見(jiàn)表3。由表3可知，本試驗(yàn)選用的回歸模型極顯著(P＜0.000 1)，失擬性檢驗(yàn)分析得 F2=1.66，相應(yīng)的P值為0.433 9，而且其相關(guān)系數(shù)R2=0.940 2，說(shuō)明該回歸方程無(wú)失擬因素存在，回歸模型與實(shí)測(cè)值能較好地?cái)M和；利用SAS軟件分析27組試驗(yàn)蛋白酶活力的預(yù)測(cè)值和實(shí)際值之間的相關(guān)系數(shù)，其結(jié)果為0.951 5，相應(yīng)的P＜0.000 1，說(shuō)明試驗(yàn)利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化發(fā)酵豆粕中蛋白酶產(chǎn)率具有科學(xué)性。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 回歸模型的方差分析

由擬合結(jié)果可知，發(fā)酵豆粕中蛋白酶酶活模型的二次多元回歸方程：Y=843.536 667-46.692 500X1+55.285X2+100.837 5X3+53.938 333X4-97.115X12+11.25X2X1-19.128 75X22-7.725X3X1+6.122 5X3X2-33.787 5X32+0.257 5X4X1+5.532 5X4X2+4.615X4X3-40.961 25X42。

利用SAS軟件處理系統(tǒng)對(duì)所得模型進(jìn)行典型性分析，以求發(fā)酵豆粕蛋白酶活最大時(shí)的最佳發(fā)酵條件，經(jīng)過(guò)分析發(fā)現(xiàn)：在X1=-0.171 586、X2=0.522 874、X3=0.743 436、X4=0.380 084時(shí)，發(fā)酵豆粕的蛋白酶活力理論值取最大值947.99 IU/g，經(jīng)換算和考慮實(shí)際操作，最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度30℃、層厚度1.75 cm、基質(zhì)含水量44%及發(fā)酵時(shí)間44 h，此條件下發(fā)酵豆粕蛋白酶活力可達(dá)907.94 IU/g。

2.2 響應(yīng)面交互作用分析(見(jiàn)圖1)

圖1反映了不同因素交互作用的影響，由圖1可知，基質(zhì)含水量對(duì)蛋白酶的產(chǎn)量影響最為顯著，這是由于隨含水量的增加，豆粕顆粒表面的水分活度隨之增加，利于微生物的生長(zhǎng)與代謝活動(dòng)的發(fā)生；但是含水量過(guò)高，豆粕顆粒之間的孔隙將減小，降低了空氣在固態(tài)培養(yǎng)基顆粒表面流動(dòng)性，造成微生物生長(zhǎng)與代謝活動(dòng)緩慢。Delabona等[10]通過(guò)試驗(yàn)證實(shí)了這種觀點(diǎn)，其發(fā)現(xiàn)豆粕基質(zhì)在高含水量時(shí)，黑曲霉產(chǎn)生的內(nèi)切葡聚糖酶活力隨含水量的增加而減少。

圖1中的等高線圖反映了不同因素交互作用的顯著性，等高線的形狀越接近橢圓，則兩因素間的交互作用越顯著，由圖可知，溫度與基質(zhì)層厚度的交互作用最顯著，其次是溫度與基質(zhì)含水量。在固態(tài)發(fā)酵中，基質(zhì)層厚度對(duì)溫度的影響不可忽略，由于固態(tài)基質(zhì)為多孔狀，熱傳導(dǎo)率較低，導(dǎo)致微生物生長(zhǎng)與代謝時(shí)產(chǎn)生的熱量不能及時(shí)傳遞到環(huán)境中，導(dǎo)致基質(zhì)內(nèi)部溫度梯度的產(chǎn)生[11]。而在固態(tài)發(fā)酵中溫度引起基質(zhì)水分的蒸發(fā)，微生物的生長(zhǎng)與代謝活動(dòng)發(fā)生在基質(zhì)顆粒表面，其介于空氣（氣相）與基質(zhì)顆粒（固相）之間，基質(zhì)表面水分活度至關(guān)重要，基質(zhì)顆粒表面的水分活度越大，越利于微生物生長(zhǎng)，但溫度越高，基質(zhì)水分蒸發(fā)速率越快，導(dǎo)致基質(zhì)水分活度迅速降低，抑制了微生物的生長(zhǎng)及代謝活動(dòng)的進(jìn)行。

2.3 恒溫發(fā)酵與變溫發(fā)酵的影響（見(jiàn)圖2）

圖1 不同因素交互作用的響應(yīng)面與等高線圖

兩種發(fā)酵模式發(fā)酵72 h后，所得的發(fā)酵豆粕顏色都為棕黃色，且散發(fā)著濃郁的醬香，表明所制備的樣品性狀正常，符合發(fā)酵豆粕的生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)。由圖2可知，相對(duì)于恒溫發(fā)酵過(guò)程，變溫發(fā)酵過(guò)程由于提高溫度抑制了微生物的生長(zhǎng)與代謝，發(fā)酵豆粕的蛋白含量在36 h后幾乎不再變化，發(fā)酵72 h后蛋白含量為53.73%，比恒溫發(fā)酵的（54.29%）低0.56%，而變溫發(fā)酵過(guò)程中在48 h時(shí)提高了發(fā)酵溫度，更有利于蛋白酶的酶解作用，因此酸溶蛋白含量在48 h后增加的更快，發(fā)酵72 h后，酸溶蛋白含量可達(dá)19.75%，比恒溫發(fā)酵提高了6.45%。

圖2 恒溫發(fā)酵與變溫發(fā)酵對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響

3 小結(jié)

目前，我國(guó)對(duì)富肽蛋白的生產(chǎn)研究多集中蛋白酶酶解大豆蛋白，其生產(chǎn)成本過(guò)高，不利于富肽飼料的工業(yè)化生產(chǎn)。本試驗(yàn)通過(guò)響應(yīng)曲面法對(duì)固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)富肽蛋白的發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化，以確定變溫發(fā)酵溫度轉(zhuǎn)變時(shí)的最佳產(chǎn)酶條件。結(jié)果表明：最佳產(chǎn)酶條件為發(fā)酵溫度30℃、層厚度1.75 cm、基質(zhì)含水量44%及發(fā)酵時(shí)間44 h，方差分析結(jié)果表明回歸模型的擬合程度良好，預(yù)測(cè)值和實(shí)際值之間的相關(guān)系數(shù)為0.951 5，由此可知，利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化得到的最佳條件科學(xué)、合理。在此基礎(chǔ)上，利用變溫發(fā)酵制備富肽蛋白，結(jié)果表明變溫發(fā)酵時(shí)微生物消耗的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)較少，而且可以產(chǎn)生更多的低分子肽類物質(zhì)，發(fā)酵72 h后，變溫發(fā)酵酸溶蛋白含量比恒溫發(fā)酵提高了6.45%。這種發(fā)酵溫度變換的策略為富肽蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)提供了技術(shù)參考。