■孫齊英彭 玲

（1.江漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430056；2.武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，湖北武漢 430065）

蛋雞汗腺不發(fā)達(dá)、代謝旺盛、體溫高，當(dāng)環(huán)境高溫超過最適等溫區(qū)（13～26℃），蛋雞極易發(fā)生熱應(yīng)激，血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、血清堿性磷酸酶（ALP）、肌酸激酶（CK）等酶的濃度、pH值及某些無(wú)機(jī)離子如K、Na、Ca、P會(huì)發(fā)生明顯變化[1]。

熱休克蛋白70（HSP70）對(duì)熱應(yīng)激機(jī)體具有分子伴侶、抗原遞呈、抗細(xì)胞凋亡、抗氧化和促進(jìn)細(xì)胞增殖等特征，能抗應(yīng)激損傷[2]。

江漢大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)免疫課題組配制和加工了一種蛋雞抗熱應(yīng)激中草藥超微粉添加劑，為探討其抗熱應(yīng)激作用機(jī)制，本文研究超微粉添加劑對(duì)蛋雞血清的酶類和HSP70的影響，旨在為該添加劑的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

53周齡伊薩褐蛋雞105只，購(gòu)于武漢鵬程禽業(yè)有限責(zé)任公司，產(chǎn)蛋率（夏季產(chǎn)蛋率80%）、體重（1.5 kg）接近。

1.2 超微粉蛋雞抗熱應(yīng)激中草藥添加劑

添加劑由江漢大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)免疫課題組研制，由黃芪、甘草、夏枯草、蘆根、生石膏、薄荷（購(gòu)于武漢九州通醫(yī)院）按一定比例混合成復(fù)方劑，粗加工成100 μm左右的粗粉，用超微粉球磨粉碎機(jī)制成粒徑小于10 μm的超微粉粉劑。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

105只伊薩褐蛋雞隨機(jī)分為5個(gè)處理組，每個(gè)處理組7個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3只雞。A組為對(duì)照組，飼喂基礎(chǔ)日糧[康地華美(武漢)產(chǎn)蛋雞配合飼料，營(yíng)養(yǎng)水平見表1]；B、C、D、E組在基礎(chǔ)日糧中分別添加0.5%、1.0%、1.5%、2.0%超微粉中草藥添加劑。

表1 配合飼料的營(yíng)養(yǎng)水平

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，3層立體籠養(yǎng)，各處理組飼養(yǎng)管理統(tǒng)一，每天飼喂4次，自由飲水，保證室內(nèi)環(huán)境衛(wèi)生，常規(guī)正常免疫，用雞舍光照自動(dòng)控制器控制每天16 h光照，光照強(qiáng)度15 lx，用空調(diào)保持室內(nèi)溫度約為27～30℃，用加濕器保持室內(nèi)濕度為80%～90%。

預(yù)試期為1周，試驗(yàn)組逐步增加添加劑喂量，直至試驗(yàn)用量。添加劑每天與飼料充分混勻后飼喂，正試期為6周。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)和方法

試驗(yàn)組和對(duì)照組蛋雞每重復(fù)選1只（每處理7只），在正試期結(jié)束后1 d翅靜脈采血取樣。血樣分離血清后檢測(cè)下列指標(biāo)：

血清的pH值用PHS-3D型pH計(jì)測(cè)定（上海精科儀器有限公司生產(chǎn)），丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、肌酸激酶（CK）、鉀（K）、鈉（Na）、鈣（Ca）、磷（P）用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)（美國(guó)雅培C8000），試劑為美國(guó)雅培Abbott原裝進(jìn)口試劑盒。

血清HSP70的含量測(cè)定采用ELISA試驗(yàn)法[3]，所用試劑為武漢貝茵萊生物公司小鼠HSP70檢測(cè)試劑盒，儀器為DNM-9602G酶標(biāo)儀。檢測(cè)步驟：

①標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔，在第一、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100 μl，在第一、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50 μl，混勻；從第一孔、第二孔中各取100 μl分別加到第三孔和第四孔，同樣的方法對(duì)其余孔進(jìn)行加樣和稀釋，第九第十孔中各取50 μl棄掉。稀釋后各孔加樣量都為50 μl，濃度分別為300、200、100、50、25 ng/l。

②加樣：分別設(shè)空白孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40 μl，再加待測(cè)樣品10 μl。用封板膜封板37℃溫育30 min。

③洗滌：揭膜，棄去液體，以洗滌液連續(xù)洗板5次，拍干。

④ 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50 μl，用封板膜封板后置37℃溫育30 min。

⑤洗滌：重復(fù)第三步。

⑥ 顯色：每孔先加入顯色劑A 50 μl，再加入顯色劑B 50 μl，37 ℃避光顯色15 min。

⑦ 終止：每孔加終止液50 μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。

⑧ 測(cè)定：450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，由曲線方程計(jì)算各樣品HSP70含量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用SAS8.0進(jìn)行方差分析和鄧肯氏多重比較。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 超微粉中草藥添加劑對(duì)蛋雞血清酶活性的影響（見表2）

表2 超微粉中草藥添加劑對(duì)蛋雞血清酶活性的影響

表2的結(jié)果表明，D、E組血清ALT含量比A組有顯著的降低（P＜0.05），D、E組之間沒有顯著性差異（P＞0.05）；A組與其他組血清AST含量沒有顯著性差異（P＞0.05）；B、C、D組血清的ALP含量較A組有顯著的提高（P＜0.05），但超微粉添加量達(dá)2.0%（E組）時(shí)，其ALP的含量反而下降，其原因尚不清楚；D、E組血清的CK含量較A組有顯著的下降（P＜0.05），而B、C組與A組沒有顯著性差異（P＞0.05）。說(shuō)明超微粉添加劑對(duì)蛋雞血清的ALT、ALP、CK影響明顯，對(duì)AST沒有明顯影響。

2.2 超微粉中草藥添加劑對(duì)蛋雞血清pH值、無(wú)機(jī)離子濃度的影響（見表3）

表3 超微粉中草藥添加劑對(duì)蛋雞血清pH值、無(wú)機(jī)離子濃度的影響

表3的結(jié)果表明，B、C組血清pH值較A組顯著降低（P＜0.05），B、C、D、E組的K較A組顯著提高（P＜0.05），各組血清Na無(wú)顯著性差異（P＞0.05），D、E組血清Ca較A組顯著提高（P＜0.05），但B、C組與A組無(wú)顯著性差異（P＞0.05），B、C、D、E組的P較A組顯著提高（P＜0.05），說(shuō)明添加劑對(duì)蛋雞血清中pH值、K、Ca、P有明顯影響，對(duì)Na的含量沒有影響。

2.3 超微粉中草藥添加劑對(duì)蛋雞血清HSP70含量的影響（見圖1）

由圖1可知，當(dāng)超微粉添加量為1.0%（C組）時(shí)，蛋雞血清的HSP70含量為372.98 ng/l，比A組提高63.3%，差異極顯著（P＜0.01），D、E組也比A組有顯著的提高（P＜0.05），B組與A組沒有顯著性差異（P＞0.05）?？梢姵⒎鄣奶砑恿窟_(dá)到0.1%以上可顯著提高蛋雞的HSP70的表達(dá)。

圖1 超微粉中草藥添加劑對(duì)蛋雞血清HSP70含量的影響

3 討論與小結(jié)

3.1 超微粉中草藥添加劑對(duì)蛋雞血清酶活性的影響

肌酸激酶(CK)的功能是催化三磷酸腺苷中的高能磷酸鍵轉(zhuǎn)移到肌酸分子上，生成磷酸肌酸而貯存能量。蛋雞熱應(yīng)激時(shí)因?yàn)榧∪饽芰抗?yīng)缺乏，肌肉營(yíng)養(yǎng)不良，導(dǎo)致肌肉細(xì)胞中的CK逸出，使血清CK濃度升高。

丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶主要存在于肝臟，熱應(yīng)激導(dǎo)致肝臟細(xì)胞損傷時(shí)會(huì)導(dǎo)致血清中ALT濃度增高[4]。

堿性磷酸酶（ALP）主要水解磷酸單脂，有研究表明，熱應(yīng)激導(dǎo)致雞血清的ALP下降[5]。

本試驗(yàn)超微粉添加劑使得蛋雞血清中的CK、ALT活性顯著降低，ALP活性顯著增高，提示超微粉添加劑具有提高蛋雞熱耐力，減少組織細(xì)胞損傷的功能。

3.2 超微粉中草藥添加劑對(duì)蛋雞血清pH值、無(wú)機(jī)離子濃度的影響

蛋雞在熱應(yīng)激時(shí)，呼吸頻率急劇上升，肺通氣過度，血中CO2的排出增多，血清中H+、HCO3-濃度下降，pH值上升，發(fā)生呼吸性堿中毒，盡管機(jī)體可以通過肺、腎臟、血液的緩沖系統(tǒng)及分泌有機(jī)酸來(lái)降低pH值，但長(zhǎng)期的高溫環(huán)境，機(jī)體的調(diào)節(jié)，特別是血中的NaHCO3/H2CO3緩沖對(duì)的調(diào)節(jié)會(huì)失去平衡[4]，本試驗(yàn)A組蛋雞血清的pH值超過了蛋雞血液pH值的正常范圍（7.30～7.40）上限值，而添加劑的使用將蛋雞的pH值降低到正常范圍。

蛋雞為了保持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，通過腎排出血液中的鈉、鉀等陽(yáng)性離子來(lái)降低血液pH值，引起血液中鈉、鉀含量的下降，引起血漿滲透壓下降，由于醛固酮的保鈉排鉀作用，使Na+在腎中的重吸收增加，K＋經(jīng)腎排出增多，血液鉀離子含量下降明顯，而Na+含量變化不明顯。

熱應(yīng)激蛋雞由于呼吸性堿中毒，血漿中的蛋白質(zhì)會(huì)釋放H+來(lái)調(diào)節(jié)血液的pH值，但其負(fù)電荷會(huì)結(jié)合血中的鈣離子，導(dǎo)致血中的游離鈣減少，血中僅有游離鈣被用于蛋殼形成、骨骼生長(zhǎng)和肌肉收縮等代謝過程，所以血鈣持續(xù)下降就會(huì)嚴(yán)重影響蛋殼的分泌，造成蛋質(zhì)下降[6-8]。

除了上述原因外，還由于熱應(yīng)激蛋雞大量飲水和排放稀便進(jìn)一步引起血液中鈉、鉀鈣、磷含量的下降。

本試驗(yàn)使用超微粉添加劑后，通過調(diào)整離子平衡，緩解了堿中毒，恢復(fù)了體液平衡。

3.3 超微粉中草藥添加劑對(duì)蛋雞血清HSP70含量的影響

HSP70能促進(jìn)蛋白質(zhì)的折疊和裝配，并幫助錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)重新折疊和降解，高溫會(huì)使蛋白質(zhì)失去原來(lái)的分子空間構(gòu)型，所以HSP70的增加可以起到分子伴侶的作用，穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)；當(dāng)熱應(yīng)激時(shí)，HSP70廣泛存在于細(xì)胞骨架內(nèi)外，與核仁和細(xì)胞膜結(jié)合，起細(xì)胞保護(hù)作用；HSP70在細(xì)胞內(nèi)能夠抑制產(chǎn)生氧自由基的關(guān)鍵酶，減少氧自由基的產(chǎn)生，發(fā)揮抗氧化功效，對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)作用[9-10]。

本試驗(yàn)使用超微粉添加劑后，增強(qiáng)了HSP70在雞體內(nèi)的表達(dá)量，增強(qiáng)了機(jī)體的熱耐受。