■包美艷 敖長(zhǎng)金 趙飛艷 薩茹麗

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

沙蔥（Allium mongolicum regel）屬被子植物門(mén)（Angiospermae）、百合科（Liliaceae），蔥屬（Allium），學(xué)名蒙古韭，蒙古語(yǔ)稱(chēng)為“胡穆利”，是一種生命力頑強(qiáng)的植物[1]。沙蔥有抑菌、抗氧化、提高免疫機(jī)能等生物活性。沙蔥多糖是沙蔥的主要活性成分之一，沙蔥多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、體外抑菌及調(diào)控瘤胃發(fā)酵等作用。扈瑞平等[2]研究發(fā)現(xiàn)，沙蔥多糖通過(guò)促進(jìn)免疫器官的生長(zhǎng)發(fā)育和小鼠免疫細(xì)胞分泌IL-2、TNF-α而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能和抗腫瘤作用。宋巴達(dá)瑪[3]研究發(fā)現(xiàn)，沙蔥多糖能提高肉羊血清中IL-2、IL-6含量，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫機(jī)能。淋巴細(xì)胞增殖是反映機(jī)體細(xì)胞免疫水平的一個(gè)重要指標(biāo)，而NO是新發(fā)現(xiàn)的一種重要的信使分子。NO具有免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)傳遞作用。因此,研究沙蔥多糖對(duì)綿羊外周血淋巴細(xì)胞增殖、NO與iNOS分泌的影響，為進(jìn)一步揭示沙蔥多糖的免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)理提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

沙蔥多糖由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與免疫實(shí)驗(yàn)室提供，使其終濃度分別為50、100、150、200、250 μg/ml，0.22 μm濾器過(guò)濾除菌。MTT（四甲基偶氮唑鹽,Amresco公司）用pH值7.2 PBS配成5 mg/ml，0.22 μm濾器過(guò)濾除菌，4 ℃避光保存。二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司)；綿羊外周血淋巴細(xì)胞分離液（TBD天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司）；PBS磷酸緩沖液[HyClone,賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司]；胎牛血清(Gibco公司)；無(wú)酚紅RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco公司)；一氧化氮及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶測(cè)定試劑盒(南京建成科技有限公司)；生物安全柜(Thermo)；CO2培養(yǎng)箱(Heal Force)；全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀(Biotek Synergy H4,美國(guó))；垂直離心機(jī)(Eppendorf,德國(guó))。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 綿羊外周血淋巴細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

在綿羊頸靜脈用含肝素鈉的無(wú)菌采血管采集40 ml血液，2 500 r/min、離心10 min，棄掉上層血漿，下面的血用等體積PBS液稀釋?zhuān)瑢⑾♂尩? ml血輕輕疊加在4 ml淋巴細(xì)胞分離液層上，經(jīng)密度梯度離心(22℃、800×g垂直離心30 min)，收集中間層白色云霧狀的單個(gè)核細(xì)胞層，得到的細(xì)胞用5倍體積的PBS液(4℃)洗滌細(xì)胞2次(2 500 r/min離心10 min)，最后用完全RPMI1640培養(yǎng)液洗細(xì)胞1次（2 500 r/min離心10 min）。將細(xì)胞重懸在4 ml含10%胎牛血清的完全RPMI1640培養(yǎng)液中。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度至5×106個(gè)細(xì)胞/ml，于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，除去貼壁細(xì)胞,收集懸浮細(xì)胞。用PBS緩沖液洗細(xì)胞2次(1 500 r/min,離心10 min)，再用完全 RPMI1640 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，即得到綿羊外周血淋巴細(xì)胞。

1.2.2 綿羊外周血淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的測(cè)定

將上述淋巴細(xì)胞用RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個(gè)細(xì)胞/ml，并分為空白對(duì)照組（PBS）和不同濃度的試驗(yàn)組接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔總體積100 μl，每組設(shè)6個(gè)重復(fù)孔。試驗(yàn)組添加沙蔥多糖的終濃度分別為50、100、150、200、250 μg/ml。置于37 ℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)24、48、72 h。每次試驗(yàn)結(jié)束前4 h，每孔加5 mg/ml的MTT溶液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。在每孔加入二甲基亞砜（DMSO）100 μl，振蕩15 min，充分溶解結(jié)晶。在酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)下測(cè)各孔吸光度（OD570），作為淋巴細(xì)胞增殖的指標(biāo)。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 綿羊外周血淋巴細(xì)胞NO含量的測(cè)定

將上述的淋巴細(xì)胞用含10%胎牛血清的無(wú)酚紅RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為8×106個(gè)細(xì)胞/ml，以無(wú)酚紅RPMI1640培養(yǎng)液作空白對(duì)照組，試驗(yàn)組添加沙蔥多糖的終濃度分別為50、100、150、200、250 μg/ml。接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔1.0 ml，每組設(shè)6個(gè)重復(fù)孔。于37℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)24 h后取100 μl細(xì)胞培養(yǎng)液測(cè)定NO含量，用酶標(biāo)儀在550 nm處測(cè)定吸光度（OD值）。計(jì)算公式：NO含量（μmol/l）=（OD1-OD3）/(OD2-OD3)×C×稀釋倍數(shù)（其中OD1為測(cè)定孔吸光度值；OD2為標(biāo)準(zhǔn)孔吸光度值；OD3為空白孔吸光度值；C是標(biāo)準(zhǔn)孔濃度20 μmol/l；稀釋倍數(shù)為4）。

1.2.4 綿羊外周血淋巴細(xì)胞iNOS活性的測(cè)定

以硝酸還原酶法測(cè)定iNOS活性。測(cè)定方法根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。計(jì)算公式：iNOS活性(U/ml)=（OD1-OD2）/38.3×10-6×2.51+A/A×1/1×15/1 000(其中OD1為測(cè)定孔吸光度值；OD2為空白孔吸光度值；A為細(xì)胞培養(yǎng)上清液)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X±S.D.）”表示,采用SAS（9.0）統(tǒng)計(jì)軟件作單因素ANOVA方差分析；多重比較采用Duncan's法。

2 結(jié)果

2.1 沙蔥多糖對(duì)綿羊外周血淋巴細(xì)胞增殖的影響（見(jiàn)表1）

表1 沙蔥多糖對(duì)綿羊外周血淋巴細(xì)胞增殖的影響

從表1可見(jiàn)，各作用時(shí)間段內(nèi)沙蔥多糖濃度為50～100 μg/ml時(shí)抑制淋巴細(xì)胞的增殖，與對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05）。沙蔥多糖濃度為150～250 μg/ml時(shí)促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖。隨著沙蔥多糖濃度的加大，對(duì)淋巴細(xì)胞增殖作用也增強(qiáng)。沙蔥多糖作用24、48、72 h后，淋巴細(xì)胞增殖作用依次顯著減弱（P＜0.05），各濃度組在3個(gè)作用時(shí)間點(diǎn)之間均差異顯著，呈現(xiàn)時(shí)效關(guān)系，其中沙蔥多糖24 h、250 μg/ml組對(duì)淋巴細(xì)胞增殖作用最強(qiáng)，與對(duì)照組相比差異極顯著（P＜0.01）；而72 h、50 μg/ml組對(duì)淋巴細(xì)胞增殖作用最弱，與對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 沙蔥多糖對(duì)綿羊外周血淋巴細(xì)胞NO含量及iNOS活性的影響（見(jiàn)表2）

表2 沙蔥多糖對(duì)綿羊外周血淋巴細(xì)胞NO及iNOS含量的影響(n=6)

由表2可見(jiàn)，沙蔥多糖濃度為50～100 μg/ml抑制NO的分泌，隨著濃度的加大，150～250 μg/ml淋巴細(xì)胞內(nèi)NO的含量有增加趨勢(shì)，其中濃度為250 μg/ml淋巴細(xì)胞內(nèi)NO的含量最高，與對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.05)，其他各組差異均不顯著(P＞0.05)。沙蔥多糖各個(gè)濃度組與對(duì)照組相比，對(duì)iNOS的影響差異不顯著(P＞0.05)，250 μg/ml沙蔥多糖組iNOS活性最高。

3 討論

3.1 沙蔥多糖對(duì)綿羊外周血淋巴細(xì)胞增殖的影響

細(xì)胞增殖試驗(yàn)是測(cè)定免疫細(xì)胞功能的方法之一。淋巴細(xì)胞受到各種因子刺激時(shí)會(huì)發(fā)生細(xì)胞增殖。在細(xì)胞增殖過(guò)程中，細(xì)胞的代謝處于旺盛狀態(tài)。細(xì)胞增殖需要大量的能量，以供合成各種大分子物質(zhì)和完成分裂過(guò)程。因此，細(xì)胞能量代謝的水平往往可以間接反映細(xì)胞增殖情況。Mosmann根據(jù)這一原理首創(chuàng)了MTT比色分析方法[4]。

趙現(xiàn)敏等[5]報(bào)道，將4種中藥多糖(板藍(lán)根多糖、牛膝多糖、山藥多糖和黃芪多糖)用MTT比色法比較對(duì)豬脾淋巴細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明，4種多糖均能顯著刺激用ConA或LPS誘導(dǎo)的豬脾淋巴細(xì)胞增殖。聶小華等[6]報(bào)道,黃芪多糖對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖具有顯著的促進(jìn)作用。王德云等[7]研究了4種濃度(150、300、600和1 200 μg/ml)的黃芪多糖對(duì)培養(yǎng)的雞脾臟淋巴細(xì)胞增殖的影響,發(fā)現(xiàn)黃芪多糖在150 μg/ml時(shí)協(xié)同ConA或LPS刺激淋巴細(xì)胞增殖的作用最強(qiáng),并提出中藥成分對(duì)體外淋巴細(xì)胞的增殖作用具有一定的量效關(guān)系。邱妍等[8]研究發(fā)現(xiàn)，牛膝多糖能促進(jìn)雛雞外周血T淋巴細(xì)胞增殖,并有一定的量效和時(shí)效關(guān)系。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，沙蔥多糖濃度為50～100 μg/ml時(shí)抑制淋巴細(xì)胞增殖，高濃度組（150～250 μg/ml）促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，并且各濃度組在3個(gè)作用時(shí)間點(diǎn)之間差異顯著(P＜0.05)，呈現(xiàn)有一定的量效和時(shí)效關(guān)系。這表明沙蔥多糖在體外對(duì)淋巴細(xì)胞增殖有調(diào)節(jié)作用。

3.2 沙蔥多糖對(duì)綿羊外周血淋巴細(xì)胞一氧化氮、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶含量的影響

一氧化氮是一氧化氮合成酶催化L-精氨酸末端胍基中的一個(gè)氮原子氧化而生成的產(chǎn)物,參與體內(nèi)多種生理病理過(guò)程。一氧化氮的體內(nèi)作用具有雙重性，既有保護(hù)作用，又有損傷作用。研究表明，巨噬細(xì)胞可受TNF、IFN2-γ等細(xì)胞因子和內(nèi)毒素脂多糖誘導(dǎo)活化，合成和釋放大量NO[9]。另?yè)?jù)文獻(xiàn)報(bào)道，D-半乳糖誘導(dǎo)的亞急性衰老小鼠皮層NO含量明顯增高，提示衰老與NO有關(guān)[10]。蘆薈多糖刺激體外培養(yǎng)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞24 h，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞NO生成量增加[11]。香菇多糖或香菇多糖協(xié)同干擾素對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞NO的產(chǎn)生具有明顯的促進(jìn)作用，香菇多糖也可以升高脾細(xì)胞內(nèi)的Ca2＋濃度、cAMP、cGMP，促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生NO[12]。NO具有殺傷腫瘤細(xì)胞活性，并且可通過(guò)增加表面分子誘導(dǎo)細(xì)胞免疫[13]。另?yè)?jù)研究表明，NO介導(dǎo)廣泛的腫瘤毒性[14]，并在腫瘤血管形成、腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起重要作用[15]。NOS信使核糖核酸廣泛分布于心血管系統(tǒng),它在相當(dāng)短的時(shí)間即可被Ca2+激活,并產(chǎn)生少量的NO[16]。Kim等[13]報(bào)道，桔梗多糖激活巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO而表現(xiàn)出殺傷腫瘤細(xì)胞的活性。Currie(1978)提出，激活的巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生精氨酸酶，使L-精氨酸轉(zhuǎn)變成鳥(niǎo)氨酸和尿素。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，精氨酸酶抑制NO合成酶，從而抑制巨噬細(xì)胞利用L-精氨酸合成NO[17]。陳炅然等[18]研究表明，蕨麻多糖能明顯促進(jìn)體外培養(yǎng)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖和一氧化氮的分泌。丁航等[19]研究發(fā)現(xiàn)，香菇多糖能刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞提高iNOS活性和NO的生成。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，沙蔥多糖濃度為50～100 μg/ml抑制NO的分泌，隨著濃度的加大，濃度為150～250 μg/ml淋巴細(xì)胞內(nèi)NO的含量有增加趨勢(shì)。但沙蔥多糖對(duì)淋巴細(xì)胞內(nèi)iNOS活性沒(méi)有顯著的作用，沙蔥多糖對(duì)綿羊外周血淋巴細(xì)胞內(nèi)iNOS活性的影響尚待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

沙蔥多糖在體外通過(guò)促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖及NO的釋放，表明其對(duì)綿羊外周血淋巴細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)作用。