■鐘 蔚 陸兆新 呂鳳霞 別小妹

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京 210095）

芽孢桿菌類微生態(tài)制劑因其獨(dú)特的芽孢存在形式，較其他種類微生態(tài)制劑具有更好的商品穩(wěn)定性，成為近年來飼用微生態(tài)制劑開發(fā)的熱點(diǎn)。許多研究人員致力于枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化，從現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道來看，多數(shù)培養(yǎng)基成分為牛肉膏、酵母膏、蛋白胨等價(jià)格較昂貴的原料[1-5]，不適用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。而選用低成本培養(yǎng)基原料的研究中，多數(shù)研究人員的目標(biāo)在于提高單位體積發(fā)酵液活菌數(shù)量[6-9]，對(duì)提高芽孢數(shù)量的研究較少。但從微生態(tài)制劑的角度考慮，芽孢數(shù)量較活菌數(shù)量在生產(chǎn)上更具實(shí)際意義。本研究對(duì)1株枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis BS1的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，以提高枯草芽孢桿菌BS1的芽孢產(chǎn)量并降低原料成本，得到適用于工業(yè)化生產(chǎn)的培養(yǎng)基配方。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

枯草芽孢桿菌 BS1（Bacillus subtilis BS1）菌株，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)酶工程研究室存留。

種子培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/l、魚粉蛋白胨10 g/l、NaCl 5 g/l，pH值7.0～7.2。

斜面及固體培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/l、魚粉蛋白胨10 g/l、NaCl 5 g/l、瓊脂15～20 g/l，pH值7.0～7.2。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 枯草芽孢桿菌（B.subtilis）BS1培養(yǎng)方法

菌種活化：將枯草芽孢桿菌BS1轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)基上，37℃靜置培養(yǎng)24 h；

種子液制備：從斜面上刮取兩環(huán)活化好的菌株接種于種子培養(yǎng)基，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)16～20 h后使用；

發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的種子液按5%(V/V)的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。

1.2.2 檢測方法

活菌計(jì)數(shù)方法：平板菌落計(jì)數(shù)法[10]。

芽孢計(jì)數(shù)方法：將待計(jì)數(shù)樣品于80℃水浴處理15 min后,再采用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，所得計(jì)數(shù)結(jié)果即芽孢數(shù)[11]。

芽孢轉(zhuǎn)化率的計(jì)算：芽孢轉(zhuǎn)化率即芽孢數(shù)占活菌數(shù)的百分比。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)

1.2.3.1 單因素試驗(yàn)

以種子培養(yǎng)基為出發(fā)培養(yǎng)基（牛肉膏3 g/l、魚粉蛋白胨10 g/l、NaCl 5 g/l，pH值7.0）。

依次替換出發(fā)培養(yǎng)基中的碳源、氮源和無機(jī)鹽物質(zhì)，其他成分不變，發(fā)酵培養(yǎng)枯草芽孢桿菌BS1，測定芽孢產(chǎn)量與芽孢轉(zhuǎn)化率，確定最佳碳源、氮源和無機(jī)鹽。

1.2.3.2 正交試驗(yàn)

分析單因素試驗(yàn)結(jié)果，綜合考慮芽孢產(chǎn)量和芽孢轉(zhuǎn)化率兩項(xiàng)指標(biāo)，確定最佳碳源、氮源和無機(jī)鹽。設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，研究碳源、氮源及無機(jī)鹽對(duì)枯草芽孢桿菌BS1芽孢形成的影響，并進(jìn)一步確定三種培養(yǎng)基組分間的最佳配比。

1.2.3.3 回歸正交組合試驗(yàn)

通過回歸正交組合試驗(yàn)，進(jìn)一步考察培養(yǎng)基組分間的交互作用對(duì)枯草芽孢桿菌BS1芽孢產(chǎn)量的影響，從而進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基配方。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同碳源對(duì)枯草芽孢桿菌BS1芽孢產(chǎn)量和芽孢轉(zhuǎn)化率的影響

以魚粉蛋白胨作為氮源，按3 g/l的添加量添加不同碳源，考察不同碳源對(duì)BS1菌株芽孢產(chǎn)量和芽孢轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 不同碳源對(duì)枯草芽孢桿菌BS1芽孢產(chǎn)量和芽孢轉(zhuǎn)化率的影響

由圖1可見，以麥芽浸粉作為碳源時(shí)，芽孢產(chǎn)量與芽孢轉(zhuǎn)化率都較其他5種碳源更高，因此選擇麥芽浸粉作為最佳碳源。

麥芽的主要成分為淀粉、還原糖、蔗糖、蛋白質(zhì)以及粗脂肪。麥芽浸粉是將麥芽中的蛋白質(zhì)酶解為小分子多肽和部分游離氨基酸而成的。淀粉是麥芽浸粉中最主要的成分，而以可溶性淀粉作為唯一碳源時(shí)，芽孢產(chǎn)量卻非常低，這一現(xiàn)象表明，當(dāng)?shù)矸叟c麥芽浸粉中的其他成分共同作用時(shí)，可有效促進(jìn)枯草芽孢桿菌BS1芽孢的形成。以蔗糖、玉米粉為唯一碳源時(shí)效果也不如麥芽浸粉理想，可以推測，單一速效碳源或單一緩效碳源都不利于BS1芽孢的形成，速效碳源（如還原糖、蔗糖）與緩效碳源（淀粉）配合使用，較有利于提高BS1的芽孢產(chǎn)量。因此，在工業(yè)化生產(chǎn)中，如果需要進(jìn)一步降低原料成本，將緩效碳源（如淀粉）與速效碳源（如葡萄糖、蔗糖）進(jìn)行復(fù)配用以替代麥芽浸粉是可行的。

2.2 不同氮源對(duì)枯草芽孢桿菌BS1芽孢產(chǎn)量和芽孢轉(zhuǎn)化率的影響

以牛肉膏作為碳源，加入10 g/l的不同氮源，考察不同氮源對(duì)BS1菌株芽孢產(chǎn)量和芽孢轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 不同氮源對(duì)枯草芽孢桿菌BS1芽孢產(chǎn)量和芽孢轉(zhuǎn)化率的影響

由圖2可見，以大豆蛋白胨為氮源時(shí)可獲得相對(duì)最高的芽孢轉(zhuǎn)化率，其次為魚粉蛋白胨、黃豆粉，但黃豆粉的芽孢產(chǎn)量遠(yuǎn)高于大豆蛋白胨和魚粉蛋白胨。造成這種結(jié)果的原因可能是，黃豆粉中含有的營養(yǎng)成分較蛋白胨更為復(fù)雜多樣，有利于枯草芽孢桿菌BS1的菌體大量生長?；谖覀冏罱K的試驗(yàn)?zāi)康氖谦@得較高的芽孢產(chǎn)量，所以選擇黃豆粉作為最佳氮源。

NH4Cl和尿素作為氮源時(shí)，芽孢產(chǎn)量與轉(zhuǎn)化率都非常低，表明以單一速效氮源作為唯一氮源既不利于BS1菌體生長，也不利于其芽孢的形成。但是，速效氮源和緩效氮源的復(fù)配，可能對(duì)菌體的生長產(chǎn)生正面作用，值得進(jìn)一步研究。

2.3 不同無機(jī)鹽對(duì)枯草芽孢桿菌BS1芽孢產(chǎn)量和芽孢轉(zhuǎn)化率的影響

以牛肉膏作為碳源，魚粉蛋白胨為氮源，加入5 g/l的不同無機(jī)鹽，考察不同無機(jī)鹽對(duì)BS1菌株芽孢產(chǎn)量和芽孢轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 不同無機(jī)鹽對(duì)枯草芽孢桿菌BS1芽孢產(chǎn)量和芽孢轉(zhuǎn)化率的影響

由圖3可見，以碳酸鈣作為無機(jī)鹽時(shí)，枯草芽孢桿菌BS1的芽孢產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率都要高于氯化鈉和硫酸錳，因此確定碳酸鈣為最佳無機(jī)鹽。

2.4 正交試驗(yàn)

通過單因素試驗(yàn)，確定了最佳碳源、氮源和無機(jī)鹽分別為麥芽浸粉、黃豆粉和碳酸鈣。為了進(jìn)一步提高芽孢產(chǎn)量，設(shè)計(jì)了L12（33）正交試驗(yàn)（正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表1）以芽孢產(chǎn)量為指標(biāo)，確定麥芽浸粉、黃豆粉和碳酸鈣三者最佳配比。正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，正交試驗(yàn)方差分析見表3。

表1 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

表2 培養(yǎng)基配方正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)方差分析

正交試驗(yàn)結(jié)果表明，在所選擇的各因素中，碳酸鈣（C）的極差最大，表明碳酸鈣對(duì)枯草芽孢桿菌BS1芽孢產(chǎn)量的影響最大，其次為麥芽浸粉（A），黃豆粉（B）對(duì)芽孢產(chǎn)量的影響最小。方差分析結(jié)果亦顯示三者對(duì)芽孢產(chǎn)量的影響在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上是顯著的，其中碳酸鈣的影響極顯著。

根據(jù)正交試驗(yàn)的數(shù)據(jù)分析結(jié)果，最優(yōu)組合應(yīng)為A1B1C3，但實(shí)際所設(shè)計(jì)的正交試驗(yàn)結(jié)果中芽孢產(chǎn)量最高的組合為A1B3C3，理論最優(yōu)組合與實(shí)際最優(yōu)組合不吻合，說明因素間存在交互作用，且這些交互作用對(duì)芽孢產(chǎn)量有較大影響，因此，在后續(xù)試驗(yàn)中，需要進(jìn)一步考察因素間的交互作用對(duì)芽孢產(chǎn)量的影響，進(jìn)而獲得更加適于枯草芽孢桿菌BS1芽孢形成的培養(yǎng)基配方。

2.5 回歸正交組合試驗(yàn)

為了考察培養(yǎng)基組分間交互作用對(duì)芽孢產(chǎn)量的影響，設(shè)計(jì)回歸正交組合試驗(yàn)（組合試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表4），試驗(yàn)結(jié)果見表5，方差分析見表6。

表4 回歸正交組合試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

利用統(tǒng)計(jì)分析軟件SAS7.0，對(duì)表5中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，得到芽孢產(chǎn)量關(guān)于麥芽浸粉、黃豆粉和碳酸鈣的二次多項(xiàng)回歸方程：

式中：Y——芽孢產(chǎn)量（cfu/ml）；

A——麥芽浸粉（g/l）；

B——黃豆粉（g/l）；

C——碳酸鈣（g/l）。

表5 培養(yǎng)基配方回歸正交組合試驗(yàn)結(jié)果

表6 回歸正交組合試驗(yàn)方差分析

通過方差分析可知，該模型顯著。相關(guān)系數(shù)R為0.93，表明該模型與實(shí)際情況擬合較好，可以通過該模型對(duì)枯草芽孢桿菌BS1的芽孢產(chǎn)量進(jìn)行預(yù)測。

由回歸方程可以看出，黃豆粉與碳酸鈣的交互作用對(duì)芽孢數(shù)量有正面影響，而麥芽浸粉與黃豆粉以及麥芽浸粉與碳酸鈣的交互作用產(chǎn)生的影響是負(fù)面的。

利用該回歸方程，并參照宋卡魏、廖春麗、王倩等人的培養(yǎng)基配方經(jīng)驗(yàn)[12-15]，最終確定培養(yǎng)基配方為：麥芽浸粉1 g/l、黃豆粉15 g/l、CaCO36.68 g/l、MnSO40.4 g/l、MgCl22 g/l，pH值7.0。

經(jīng)過5次驗(yàn)證試驗(yàn)，在37℃、180 r/min條件下培養(yǎng)48 h,枯草芽孢桿菌BS1菌株的平均芽孢產(chǎn)量可達(dá)8.55×1010cfu/ml。