■魏 澍 劉金玲 單風(fēng)平 孫婷婷 趙 鷺 王藝凝

(1.遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧沈陽 110164；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽 110866；3.中國醫(yī)科大學(xué)免疫教研室，遼寧沈陽 110001)

雞馬立克氏?。∕arek's Disease，MD）是由馬立克氏病毒（Marek's Disease Virus,MDV）引起的一種淋巴細(xì)胞增生性腫瘤疾病，通常以外周神經(jīng)和包括虹膜及皮膚在內(nèi)的其他各種器官和組織的單核細(xì)胞浸潤為特征。2005年，歐洲、澳大利亞、南美洲、亞洲相繼發(fā)生了MD強(qiáng)毒株的流行，死亡率在50%～60%，在 2008年到2011年，我國四川和新疆等地區(qū)相繼爆發(fā)了該病，死亡率為15%～80%，給我國的養(yǎng)禽業(yè)造成的損失達(dá)數(shù)千萬元甚至上億元。由于MDV有向更強(qiáng)毒力進(jìn)化的傾向，現(xiàn)有疫苗并不能對(duì)所有的強(qiáng)毒株提供完全的保護(hù)，免疫失敗屢有發(fā)生，造成該病在局部地區(qū)爆發(fā)，給本病的防制帶來了新的問題]。蛋氨酸腦啡肽（MENK）是一種內(nèi)源性的阿片肽，具有可逆性，無細(xì)胞毒性，近年來研究發(fā)現(xiàn)，適宜濃度的MENK通過作用于免疫細(xì)胞，激活免疫系統(tǒng)細(xì)胞，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用和腫瘤殺傷的作用。因此，MENK對(duì)MSB-1細(xì)胞也可能存在增殖抑制及凋亡促進(jìn)作用，目前尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)的禽馬立克細(xì)胞株MSB-1為研究對(duì)象，探討MENK對(duì)MSB-1細(xì)胞形態(tài)學(xué)、增殖抑制率及早期凋亡率的影響，為進(jìn)一步深入研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

禽馬立克MSB-1細(xì)胞株(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生化教研室保存)；蛋氨酸腦啡肽(中國醫(yī)科大學(xué)免疫教研室贈(zèng)送)；Anmexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物發(fā)展有限公司）；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）購自鼎國生物技術(shù)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

使用10%胎牛血清，青鏈霉素各100 U/ml的RPIM-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)MSB-1細(xì)胞，每3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于試驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

在培養(yǎng)的過程中，將細(xì)胞分為RPIM-1640空白對(duì)照組和10-12mol/l MENK處理組并用倒置顯微鏡觀察不同時(shí)間點(diǎn)MSB-1細(xì)胞形態(tài)的變化。

1.2.3 MTT法檢測(cè)MENK對(duì)禽馬立克細(xì)胞株MSB-1增殖的影響

取對(duì)數(shù)生長期MSB-1細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為(2～5)×104個(gè)/ml，每孔200 μl(約103個(gè)細(xì)胞)接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)4 h，MENK組加入終質(zhì)量濃度為10-12mol/l的MENK，各設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別在24、48、72 h后加入MTT溶液20 μl（5 g/l），培養(yǎng)4 h后吸棄培養(yǎng)基，加入150 μl DMSO，震蕩10 min用酶標(biāo)儀在490 nm波長下測(cè)定各孔吸光度值(A)，計(jì)算細(xì)胞生長抑制率。細(xì)胞生長抑制率(%)=l-(實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)。

1.2.4 細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)

收集對(duì)數(shù)生長期的MSB-1細(xì)胞，密度為1×105個(gè)/ml。并接種到六孔板中，每孔加入細(xì)胞懸液200 μl及 RPIM-1640培養(yǎng)基2 ml，于 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，MENK處理組加入10-12mol/l MENK干預(yù)，并設(shè)RPMI-1640空白對(duì)照組繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集MSB-1細(xì)胞，4℃ 1×PBS洗滌細(xì)胞2次后棄上清液，加入BindingBuffer調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/ml，取0.1 ml細(xì)胞懸液至流式管中，加入Annex?in V-FITC和PI各5 μl混勻,4 ℃避光反應(yīng)30 min。加人400 μl BindingBuffer，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞所占的比例。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS（17.0）統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

倒置顯微鏡下觀察RPIM-1640對(duì)照組和10-12mol/l的MENK處理組的禽馬立克細(xì)胞株MSB-1細(xì)胞，可見對(duì)照組MSB-1細(xì)胞呈懸浮生長，細(xì)胞呈圓形或梭形，邊緣整齊，胞質(zhì)透亮生長狀態(tài)良好，分布密集，而MENK處理組在培養(yǎng)24 h后，胞質(zhì)透亮度下降，界限不清，顆粒感增強(qiáng)，并見細(xì)胞碎片逐漸增多，細(xì)胞體積變小(見圖1)。

圖1 倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)變化(400×)

2.2 MENK對(duì)MSB-1的增殖抑制率

用MTT比色法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖抑制情況，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示10-12mol/l的MENK能夠抑制MSB-1細(xì)胞株的增殖，并且這種抑制具有時(shí)效性，在24 h和48 h MENK處理組細(xì)胞的增殖抑制率明顯低于RPIM-1640對(duì)照組，差異極顯著(P＜0.01)，在 72 h 時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 各組吸光度檢測(cè)結(jié)果（X±S）

2.3 MENK誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生的比率

細(xì)胞凋亡率流式細(xì)胞儀圖示中以AnnexinV為橫軸，PI為縱軸表示MSB-1細(xì)胞的凋亡情況，左上為機(jī)械性損傷細(xì)胞，右上為晚期凋亡細(xì)胞或壞死細(xì)胞，左下為陰性正常細(xì)胞，右下為早期凋亡細(xì)胞。流式統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，MENK誘導(dǎo)MSB-1細(xì)胞早期凋亡率為(62.04±3.32)%，高于RPIM-1640正常對(duì)照組[(5.05±0.61)%]，二者差異極顯著（P＜0.01），而晚期凋亡及壞死率高于RPIM-1640正常對(duì)照組(P＜0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2。

圖2 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

3 討論

對(duì)蛋氨酸腦啡肽的早期藥用價(jià)值研究是將其作為鎮(zhèn)痛劑和神經(jīng)遞質(zhì)來進(jìn)行的，后來人們認(rèn)為，MENK不但具有神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)活性，也是一類重要的免疫調(diào)控因子，于是通過研究蛋氨酸腦啡肽對(duì)免疫系統(tǒng)、腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的作用，發(fā)現(xiàn)蛋氨酸腦啡肽參與免疫反應(yīng)的調(diào)控、影響細(xì)胞增殖，因此人們逐漸將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到與免疫系統(tǒng)相關(guān)的疾病上，如腫瘤、艾滋病。從1983年起,MENK抗腫瘤的研究已經(jīng)被大量的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)所證實(shí)。Zagon等研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用10-6mol/l濃度的MENK刺激體外培養(yǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞(HT-29)，在12～72 h內(nèi)可明顯抑制細(xì)胞的生長。Zagon和他的研究團(tuán)隊(duì)通過對(duì)人頭頸部鱗狀細(xì)胞癌來源的胰腺癌及結(jié)腸癌研究證實(shí)，MENK對(duì)于癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、趨化、定植及粘連等作用的控制具有十分重要的意義，同時(shí)MENK對(duì)細(xì)胞生長具有雙向調(diào)控作用，即在低濃度時(shí)，MENK抑制細(xì)胞生長，而高濃度時(shí)卻促進(jìn)細(xì)胞生長。本課題組前期工作基礎(chǔ)表明10-8～10-12mol/l的MENK均具有生物活性，發(fā)揮免疫功能，但在10-12mol/l時(shí)具有最佳的免疫調(diào)控功能，因此本研究采用了10-12mol/l MENK作用禽馬立克細(xì)胞株MSB-1，發(fā)現(xiàn)10-12mol/l的MENK能夠明顯抑制MSB-1的增殖，抑制率為19%～46%，高于RPIM-1640對(duì)照組，倒置顯微鏡形態(tài)學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示在10-12mol/l MENK作用24 h后，MENK處理組細(xì)胞密度逐漸降低，細(xì)胞形態(tài)也由圓形變得逐漸不規(guī)則，甚至皺縮，流式凋亡檢測(cè)結(jié)果表明，10-12mol/l MENK能夠誘導(dǎo)MSB-1細(xì)胞株的早期凋亡，并且凋亡率顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），從而表明MENK在體外能夠誘導(dǎo)MSB-1腫瘤細(xì)胞凋亡及壞死發(fā)揮抗MSB-1腫瘤作用，是一種潛在的新型抗腫瘤藥物。由于本實(shí)驗(yàn)為體外實(shí)驗(yàn)，MENK在體內(nèi)對(duì)MSB-1細(xì)胞的作用和在體外對(duì)MSB-1細(xì)胞的作用可能并不完全一致，因此下一步我們將通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步研究，并探討MENK抗腫瘤的相關(guān)機(jī)制為揭示MENK抗疾病的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。