丁雯雯,王文華,孫立榮

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,山東青島 266003 1 血液兒科; 2 藥劑科)

藏紅花素對骨髓造血干-祖細(xì)胞集落形成的影響

丁雯雯1,王文華2,孫立榮1

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,山東青島 266003 1 血液兒科; 2 藥劑科)

目的探討藏紅花素對骨髓造血干-祖細(xì)胞集落形成的影響。方法采用甲基纖維素半固體培養(yǎng)基對骨髓單個核細(xì)胞進(jìn)行集落培養(yǎng),分為空白對照組及濃度為0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 g/L藏紅花素組,培養(yǎng)14 d進(jìn)行集落計數(shù)。結(jié)果藏紅花素濃度≤1.00 g/L時隨藏紅花素濃度增加集落計數(shù)增加,1.00 g/L時增加最顯著;藏紅花素濃度增加至2.00 g/L時集落計數(shù)減少,增加至4.00 g/L時不形成集落。結(jié)論適宜濃度的藏紅花素(0.50～1.00 g/L)可提高骨髓造血干-祖細(xì)胞集落形成。

藏紅花素;造血干細(xì)胞;細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

過去20年中,大量植物來源的天然化合物被發(fā)現(xiàn)具有抗癌作用,中草藥亦被越來越多地用于腫瘤病人的治療中。藏紅花是鳶尾科植物家族,自古以來就被民間醫(yī)學(xué)廣泛應(yīng)用,其花柱頭含有的藏紅花素、花青素、胡蘿卜素和番茄紅素等,是已知的具有藥理活性的成分[1]。研究結(jié)果顯示,藏紅花提取液可對多種腫瘤產(chǎn)生抑制作用,包括白血病、骨肉瘤、纖維肉瘤和卵巢癌等[2]。藏紅花素的細(xì)胞保護(hù)作用則在近年來備受關(guān)注,已有研究結(jié)果表明,藏紅花素具有很強(qiáng)的清除自由基的能力,其多種藥學(xué)作用可能與此相關(guān),包括改善乙醇引起的小鼠學(xué)習(xí)能力下降、降血脂、抗動脈粥樣硬化等[3-6]。藏紅花素可小幅度提高Dalton淋巴瘤移植小鼠的外周血中性粒細(xì)胞計數(shù),其機(jī)制尚未闡明,而藏紅花素在體外對骨髓造血干-祖細(xì)胞的影響尚未見報道。本研究旨在探討藏紅花素對骨髓造血干-祖細(xì)胞集落形成的影響,為藏紅花素應(yīng)用于腫瘤治療提供理論基礎(chǔ)。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

藏紅花素、甲基纖維素、牛血清清蛋白V均購自美國Sigma公司,胎牛血清(FBS)、IMDM購自美國Hyclone公司,SCF、IL-3、GM-CSF、G-CSF、EPO均購自美國Peprotech公司,2-巰基乙醇購自吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司,馬血清購自廣州蕊特生物科技有限公司,Ficoll-Pague購自天津灝洋生物制品科技有限公司。

1.2 藏紅花素溶液的配制

無菌條件下將1 g藏紅花素溶于20 m L IMDM中,并加62.5 mg EDTA配成50 g/L溶液,4℃貯存。臨用時用IMDM稀釋為適當(dāng)濃度。

1.3 骨髓單個核細(xì)胞(MNC)提取

骨髓標(biāo)本來自本院血液兒科6例急性淋巴細(xì)胞白血病病兒(化療后骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)完全緩解、外周血中性粒細(xì)胞計數(shù)＞1.5×1012/L)。取胸骨骨髓0.5 m L,按下述操作提取MNC:①EDTA抗凝的骨髓按1∶2的比例與細(xì)胞緩沖液(含體積分?jǐn)?shù)0.02 FBS的IMDM,下同)混勻;②在另外的離心管中加入分離液(Ficoll-Pague,比密度1.077),將等體積的骨髓細(xì)胞懸液沿管壁緩慢加至分離液面上,盡量保持界面清楚,20℃下2 000 r/min離心12 min;③取分離液和最上層IMDM液間的白色云霧層狹窄帶750μL,加入4～5 m L細(xì)胞緩沖液中,1 500 r/min離心10 min,洗滌細(xì)胞2次,即得到單個核細(xì)胞;④1 m L IMDM培養(yǎng)液與單個核細(xì)胞制成細(xì)胞懸液,調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至2×108/L。

1.4 集落培養(yǎng)

甲基纖維素半固體培養(yǎng)基含2-巰基乙醇1.45× 10－2mol/L,體積分?jǐn)?shù)0.30馬血清,體積分?jǐn)?shù)0.01 BSA,EPO 1 k U/L,SCF 50μg/L,IL-3 50μg/L, GM-CSF 20μg/L,G-CSF 20μg/L,甲基纖維素9 g/L,青-鏈霉素105U/L。將MNC培養(yǎng)于24孔培養(yǎng)板中,分為空白對照組(A組)和0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 g/L藏紅花組(B～G組),每組3個復(fù)孔,IMDM補齊至每孔0.5 m L,調(diào)整每孔細(xì)胞密度107/L,在37℃、體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)14 d后進(jìn)行集落計數(shù),取3個復(fù)孔平均值為該組集落數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計的方差分析對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,組間兩兩比較采用LSD法,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 藏紅花素對造血干-祖細(xì)胞總集落形成影響

藏紅花素濃度為4.00、8.00 g/L時無集落形成,故下文中省略該兩組。藏紅花素影響骨髓造血干-祖細(xì)胞總集落形成,D組的總集落數(shù)較其他各組均顯著增加,E組較D組及C組均有顯著下降(F＝37.3,P＜0.05),B組與A組比較,差異無顯著意義(P＞0.05)。在藏紅花素濃度≤1.00 g/L時,總集落形成數(shù)與藏紅花素濃度呈正相關(guān)(r＝0.834,P＜0.01)。見表1。

2.2 藏紅花素對紅系集落形成的影響

藏紅花素影響紅系集落形成,以D組及E組紅系集落形成的增加最明顯(F＝6.6,P＜0.05),而D組與E組之間差異無顯著性(P＞0.05)。在藏紅花素濃度為0.25～2.00 g/L時,紅系集落數(shù)與藏紅花素濃度呈正相關(guān)(r＝0.690,P＜0.01)。見表1。

2.3 藏紅花素對造血干-祖細(xì)胞總集落與紅系集落形成的影響比較

藏紅花素濃度≤1.00 g/L時總集落形成及紅系集落形成均隨濃度增加而增加,但紅系集落所占百分比不足20%,至2.00 g/L時總集落數(shù)顯著減少,而紅系集落數(shù)無明顯改變,紅系集落所占百分比達(dá)到33.3%,高于其他組。見表1。

3 討 論

藏紅花素是一種新的抗腫瘤藥物,許多實驗證實藏紅花素可增加細(xì)胞凋亡,抑制腫瘤細(xì)胞增殖。而近年來研究顯示,藏紅花素具有細(xì)胞保護(hù)作用,包括延長低氧小鼠的存活時間,保護(hù)低氧心肌細(xì)胞,抑制CCl4引起的肝損傷等[7-9],可能與藏紅花素提高超氧化物歧化酶活性、清除細(xì)胞自由基有關(guān),這與青紫薯色素、人參皂甙等中草藥具有相似的作用[10-11]。HAMID等[12]研究顯示,藏紅花素能抑制Dalton淋巴瘤移植小鼠的腫瘤生長,同時不引起小鼠血紅蛋白及中性粒細(xì)胞含量下降,且中性粒細(xì)胞百分?jǐn)?shù)及絕對計數(shù)較正常對照組有小幅度升高。

本文結(jié)果顯示,適宜濃度的藏紅花素(0.25～1.00 g/L)可顯著增強(qiáng)體外造血干-祖細(xì)胞集落形成,說明藏紅花素對造血干-祖細(xì)胞具有保護(hù)作用,可在造血干-祖細(xì)胞水平干預(yù)外周血細(xì)胞成分。但是藏紅花素濃度增至2.00 g/L時總集落形成顯著下降,至4.00 g/L時沒有集落形成。本課題組既往實驗也顯示,藏紅花素在適宜濃度范圍內(nèi)顯示細(xì)胞保護(hù)作用,高濃度則引起細(xì)胞壞死,提示高濃度的藏紅花素具有細(xì)胞毒性作用。藏紅花素對紅系集落形成的影響主要體現(xiàn)在在2.00 g/L時總集落形成顯著下降而紅系集落形成不受影響,提示在高濃度藏紅花素作用下,紅系造血干-祖細(xì)胞更能耐受藏紅花素的毒性作用。藏紅花素對紅系集落及非紅系集落形成的影響具有濃度差異性。藏紅花素濃度在≤1.00 g/L時非紅系集落占到80%以上,且非紅系集落的增加程度較紅系集落高(54%∶36%),提示藏紅花素在此濃度范圍內(nèi)以增加非紅系集落形成為主,這可以解釋藏紅花素處理的Dalton淋巴瘤移植小鼠外周血中性粒細(xì)胞升高的現(xiàn)象。

藏紅花素增加造血干-祖細(xì)胞集落形成的機(jī)制尚不明確。既往研究顯示,藏紅花素可以顯著刺激γ-谷胱甘肽m RNA表達(dá),通過增加谷胱甘肽合成來抑制神經(jīng)鞘磷脂酶活性和神經(jīng)酰胺合成,起到神經(jīng)保護(hù)作用[13];通過抑制過氧化物酶、超氧化物歧化酶m RNA的表達(dá)降低氯化鈹介導(dǎo)的氧化應(yīng)激[14];抑制膠原引起的血小板內(nèi)源性活性氧自由基及過氧化氫的產(chǎn)生[15]。此外,LI等[16]研究則顯示,與藏紅花素類似的一種中藥提取物紅景天苷,同樣具有抗氧化作用,能激活細(xì)胞內(nèi)聚ADP核糖聚酶1(一種細(xì)胞損傷修復(fù)中重要的酶),降低造血干細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。因此,我們推測,藏紅花素提高造血干-祖細(xì)胞集落形成與其抗氧化應(yīng)激作用有關(guān)。造血干-祖細(xì)胞在提取過程中產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷,藏紅花素通過上述抗氧化應(yīng)激作用機(jī)制對造血干-祖細(xì)胞進(jìn)行修復(fù),減少造血干-祖細(xì)胞丟失。具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本實驗證實了藏紅花素能增強(qiáng)體外造血干-祖細(xì)胞集落形成,這與傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物明顯不同,預(yù)示藏紅花素具有更低的骨髓抑制作用,可以成為高效低毒的抗腫瘤藥物,因而理論上講是更理想的化療藥物,但其應(yīng)用于臨床尚需要更多的實驗研究。

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(本文編輯 馬偉平)

EFFECTS OF CROCIN ON COLONY-FORMING OF HEMATOPOIETIC PROGENITOR CELLS

DING Wenwen,WANG Wenhua,SUN Lirong(The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College,Qingdao 266003,China)

ObjectiveTo study the effects of crocin on the colony-forming of bone marrow hematopoietic progenitor cells (BMHPCs).MethodsBy using methylcellulose-based colony-forming assay,a colony culture was conducted for a single marrow cell,which was then divided into blank group and 0.25,0.50,1.00,2.00,4.00 and 8.00 g/L crocin group.Colony count was done after 14 day cultivation.ResultsWhen the crocin concentration was at≤1.00 g/L,the number of cell colony increased along with the increase of the concentration,the highest was noted at 1.00 g/L;the cell colony decreased when the crocin concentration up to 2.00 g/L,and no cell colony was formed when it reached 4.00 g/L.ConclusionSuitable concentration(0.50－1.00 g/L)of crocin can increase the formation of hematopoietic progenitor cells.

crocin;hematopoietic stem cells;cell culture ttechniques

R932

A

1008-0341(2013)04-0346-03

10.11712/qlyx201304021

2013-02-17;

2013-06-03

西藏自治區(qū)科委資助項目

丁雯雯(1986-),女,碩士研究生。

孫立榮(1961-),女,博士,主任醫(yī)師,博士生導(dǎo)師。