張繼琛，婁 凱，閆李俠 (浙江省臺州市第一人民醫(yī)院，溫州醫(yī)學院附屬黃巖醫(yī)院，浙江 臺州 318020)

微小RNA(miRNA)是一種小的非編碼RNA，與靶mRNA的3'UTR完全或者不完全結(jié)合，降解靶mRNA或者抑制靶mRNA翻譯。miRNA與細胞增殖、分化、凋亡、造血調(diào)控和脂肪代謝等過程密切相關。微小RNA(microRNA)是一類長約22nt的非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達。大量實驗表明miRNA參與了細胞增殖、分化和凋亡，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要的調(diào)控作用［1］。近來，microRNA－451(miR－451)在乳腺癌、卵巢癌及胃癌研究中均有報道［2－4］，但在肺癌方面報道較少，為探討miR－451在肺癌發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮的作用，筆者在體外驗證miR－451在正常肺細胞株及肺癌細胞株的表達差異，通過臨床標本檢測該小分子在正常肺臟組織、癌旁組織及肺細胞癌中的表達，為進一步探討miR－541在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制奠定基礎，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料:培養(yǎng)基高糖DMEM購自Hycolone公司，胎牛血清為美國Gibco公司生產(chǎn)。Bulge.100p1M miRNA定量聚合酶鏈反應(PCR)引物試劑盒購于廣州銳博生物科技有限公司。Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司。Trizol試劑購自Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄(RT)試劑盒購自ToYoBo公司，PCR試劑盒購自Fermentas公司;其他試劑皆為分析純。CCK.8試劑盒購自蘇州碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染:NSCLC肺癌細胞株A549由中國科學院上海細胞生物研究所提供。用含10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃，5%(體積分數(shù))CO2:培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細胞消化后種于96孔板，待細胞密度達到30% ～50%采用lipo－2000脂質(zhì)體將不同濃度(5 nmol/L、10 nmol/L、20 nmol/L)的miR－451模擬物及陰性對照轉(zhuǎn)入細胞中，每組6孔，轉(zhuǎn)染后0、24 h、48 h、72 h分別采用 WST－8測定細胞存活率并繪制生長曲線，試驗重復3次。

1.2.2 組織來源及患者特點:共有組織35例，患者年齡45～75歲，所有病例組織來自于溫州醫(yī)學院附屬黃巖醫(yī)院胸外及呼吸內(nèi)科，標本取自手術切除肺癌組織、肺癌周圍組織以及肺癌周圍正常肺組織。①肺癌組織:取自實性癌中未壞死的區(qū)域。②癌周組織:肺癌周圍2 cm以內(nèi)的未壞死組織。③正常肺組織:肺癌周圍3 cm以外的未壞死組織。所有患者術前未接受任何抗腫瘤藥物治療，未進行介入治療。組織標本離體后，立即放入液氮冷藏，－80℃保持備用。

1.2.3 實時定量PCR檢測miR－451表達水平:①總RNA的提取:收取細胞沉淀后直接用Trizol重懸，組織加入1 ml Trizol后用勻漿器研磨，加入200μl氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫靜置10 min后，12 000 r/min，4℃離心15 min，吸取上層水相加入等體積預冷的異丙醇，置于－20℃冰箱30 min以上;再采用12 000 r/min，4℃ 離心 15 min，棄上清，75%乙醇(無 RNA 酶水配置)漂洗RNA沉淀，DEPC水溶解RNA沉淀。根據(jù)Bulge－LoopTMmiRNA定量PCR引物試劑盒說明書操作，取2μg總RNA，加入內(nèi)參U6及目的小分子RNA miR－451逆轉(zhuǎn)錄引物，70℃ 10 min，混合物取出后立即置冰上，冰育2 min，隨后加入逆轉(zhuǎn)錄其他試劑。RT反應程序為:42℃ 60 min，70℃10 min。RT反應結(jié)束后立即將cDNA產(chǎn)物取出，快速置冰上冷卻，置－80℃?zhèn)溆?。②實時定量PCR:以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，在實時定量PCR儀上進行PCR擴增。PCR擴增體系:10μg 2×SYBR@Green Realtime PCR Master Mix(Toyobo)，10 μmol/L 5'及3'引物0.5 μl，1 μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，加滅菌雙蒸水至20μl。反應條件為:95℃預變性1 min，95℃ 15 s，60℃20 s，70℃ 10 s，共40個循環(huán)。溶解曲線反應條件:95℃ 15 s，60℃ 15 s，95℃ 15 s。采用相對定量方法計算靶miRNA相對表達量，計算公式為:相對miRNA表達量=2－(⊿Ct樣品－⊿Ct對照)。Mir－451及其內(nèi)參U6的引物購于購于廣州銳博生物科技有限公司。③CCK－8試劑盒檢測細胞增殖:待測細胞96孔板每孔加入10μl CCK－8溶液。同時用加了相應量細胞培養(yǎng)液和CCK－8溶液，但未加入細胞的孔作為空白對照。在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育0.5～4.0 h。采用酶標儀在450 min波長處測定A值。

1.3 統(tǒng)計學分析:數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用t檢驗，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 miR－451在正常胚肺細胞株及肺癌細胞株中的表達:mir－541在肺癌細胞(A549)中的表達比正常肺細胞顯著降低(0.294±0.066、0.894±0.023)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.2 miR－451模擬物抑制腫瘤細胞的增殖:分別給予肺癌細胞株 A549不同濃度(5 nmol/L、10 nmol/L、20 nmol/L)的miR－145模擬物處理后，不同濃度均可使其增殖能力明顯減弱，5 nmol/L可出現(xiàn)抑制作用，10 nmol/L效應明顯，但10 nmol/L同20 nmol/L效應無顯著差異，故采用10 nmol/L濃度處理細胞后進行不同時間點細胞增殖能力檢測。細胞增殖在24 h即出現(xiàn)明顯抑制，72 h仍有抑制效應。

2.3 miR－145在正常組織、癌周組織、癌組織中的表達:在癌組織中表達顯著低于正常組織與癌周組織(0.124±0.002、0.870±0.034、0.896±0.008)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，前者降低7倍(P＜0.05)，正常組織及癌周組織比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

3 討論

miRNA在細胞的增殖、分化等方面發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。多種miRNAs與腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程密切相關，miRNA通過調(diào)節(jié)其靶mRNA的表達發(fā)揮促進或者抑制腫瘤進展的作用。作為轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達的關鍵因子，該小分子的出現(xiàn)對腫瘤發(fā)生機制的闡明、腫瘤治療及預后均具有重要意義。miR－451為眾多小分子RNA中的一員，miR－451位于染色體17q 11.2，與原癌基因人類表皮生長因子受體2的17q 11.2－21區(qū)域臨近［5－6］。然而，miR －451在腫瘤方面作用的研究尚處于初級階段。2005年Ahuvia等首次發(fā)現(xiàn)miR－451［7］。2009年Bandres等研究發(fā)現(xiàn)miR－451與預后不良相關［4］。與無瘤組織相比，原位雜交顯示胃癌和結(jié)腸癌上皮細胞miR－451表達降低。胃癌細胞AGS和結(jié)腸癌上皮細胞DLDI。miR－451過表達則降低細胞擴增及增加放射敏感性。微陣列及生物信息學分析鑒別出新的致癌基因巨噬細胞遷移抑制因子(MIF)是miR－451的潛在靶點，而MIF是參與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的重要因子［8－9］。2010年 Godlewski等研究 miR －451表達對腦膠質(zhì)瘤遷移的影響［10］。2007年Brueckner等研究發(fā)現(xiàn)miRNA－451在支氣管肺泡干細胞保持自我更新能力中發(fā)揮重要作用，深入研究發(fā)現(xiàn)miR－451通過影響細胞骨架而調(diào)控遷移［11］。在肺癌與miRNA研究中，2011年蘭海等研究在非小細胞肺癌中高表達的miR－21對腫瘤細胞的增值和凋亡有重要調(diào)節(jié)作用，抑制腫瘤抑制基因程序性細胞死亡因子4的表達［12］。Chen等研究將miR－145轉(zhuǎn)染至非小細胞肺癌細胞后，癌細胞的原癌基因c－myc表達下調(diào)，增殖受到抑制［13］。

本研究結(jié)果表明，miR－451的低表達在肺細胞癌的發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮著重要作用，它可能作為肺細胞癌惡性行為的重要標志，同時也為治療及預后提供一些理論基礎。

［1］ Wang Y，Lee CG.MicroRNA and cancer－focus on apoptosis［J］.J Cell Mol Med，2009，13(1):12.

［2］ Kovalchuk O，F(xiàn)ilkowski J，Mesew J，et al.Involvement of microRNA－451 in resistance of the MCF－7 breast cancer cells to chemotherapeutic drug doxorubicin［J］.Mol Cancer Ther，2008，7(7):2152.

［3］ Zhu H，Wu H，Liu X，et al.Role of MicroRNA miR －27a and miR－451 in the regulation of MDR1/P－glycoprotein expression in human cancer cells［J］.Biochem Pharmacol，2008，76(5):582.

［4］ Bandres E，Bitarte N，Arias F，et al.MicroRNA －451 regulates macrophage migration inhibitory factor production and proliferation of gastrointestinal cancer cells［J］.Clin Cancer Res，2009，15(7):2281.

［5］ Mahlamaki EH，Barlund M，Tanner M，et al.Frequent amplification of 8q24，11q，17q，and 20q － specific genes in pancreatic cancer［J］.Genes Chromosomes Cancer，2002，35(4):353.

［6］ Kang CS，Pu PY，Wang GX，et al.Inhibitory effects of siRNA targeting epidermal growth factor receptor on proliferation and invasion of human glioblastoma cells［J］.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2004，84(18):1503.

［7］ Altuvia Y，Landqraf P，Lihwick G，et al.Clustering and conservation patterns of human microRNAs［J］.Nucleic Acids Res，2005，33(8):2697.

［8］ Verjans E，Noetzel E，Bektas N，et al.Dual role of macrophage migration inhibitory factor(MIF)in human breast cancer［J］.BMC Cancer，2009，9:230.

［9］ He XX，Chen K，Yang J，et al.Macrophage migration inhibitory factor promotes colorectal cancer［J］.Mol Med，2009，15(1 －2):1.

［10］ Godlewski J，Nowicki MO，Bronisz A，et al.MicroRNA －451 regulates LKB1/AMPK signaling and allows adaptation to metabolic stress in glioma cells［J］.Mol Cell，2010，37(5):620.

［11］ Brueckner B，Streemann C，Kuner R，et al.The human let－7a－3 locus contains an epigenetically regulated microRNA gene with oncogenic function［J］.Cancer Res，2007，67(4):1419.

［12］ 蘭 海，林叢堯，袁宏銀，等.miR－21調(diào)控非小細胞肺癌細胞增殖和凋亡的機制研究［J］.中華腫瘤雜志，2011，33(3):742.

［13］ Chen Z，Zenq H，Guo Y，et al.miRNA －145 inhibits non－small cell lung cancer cell proliferation by targeting c－Myc［J］.J Exp Clin Cancer Res，2010，29:151.