■ 郭曉明 高安翔 陸圣杰 許甲平馮一凡 吳亞斌

（1.上海應用技術學院化學與環(huán)境工程學院，上海 201418;2.上海德邦牧業(yè)有限公司，上海 201108）

甘氨酸亞鐵具有穩(wěn)定性好、吸收率高、無胃腸刺激及生物學效價高的特點，是新一代的補鐵添加劑[1]。在飼料中添加甘氨酸亞鐵為防治動物貧血癥和增強動物免疫力提供了一條高效、安全、簡便的途徑。

甘氨酸亞鐵產(chǎn)品中游離甘氨酸（未螯合的甘氨酸）的含量反映生產(chǎn)過程中甘氨酸與亞鐵離子的螯合率，在一定的前提條件下也能反映甘氨酸亞鐵的穩(wěn)定性，是評價生產(chǎn)工藝和產(chǎn)品性能的一項重要指標，當前主要采用非水滴定法測定[2]。

本文采用分光光度法來測定甘氨酸亞鐵產(chǎn)品中游離甘氨酸的含量?？疾炝孙@色劑濃度、還原劑濃度、顯色反應時間及溫度等參數(shù)對吸光度的影響，確定了最佳顯色條件，繪制了工作曲線并應用于實際樣品的測試，獲得了較好的測定結(jié)果。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

雙光束紫外可見分光光度計（TU-1901，北京普析通用儀器有限責任公司）、循環(huán)水式真空泵（河南鞏義予華儀器廠）、恒溫水浴槽（HHS-21，上海博迅醫(yī)療設備有限公司）、電子天平（BS224S，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）、微量移液器（大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司）。

甘氨酸、茚三酮、抗壞血酸、乙醇、乙二醇甲醚、冰醋酸、無水醋酸鈉均為分析純（國藥集團化學試劑公司），甘氨酸亞鐵由作者實驗室自行制備。茚三酮用乙二醇甲醚溶解，配制成3%(wt.%)的溶液，抗壞血酸用去離子水溶解，配制成0.3%(wt.%)的溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 實驗方法

1.2.1 顯色反應條件的確定

稱取30 mg甘氨酸，加入到50 ml冰醋酸中，攪拌溶解，轉(zhuǎn)移到100 ml的容量瓶中，用1 mol/l的醋酸鈉定容。從中移取10 ml再用1 mol/l醋酸鈉溶液定容至100 ml。移取5.0 ml該溶液到25 ml的容量瓶中，加入抗壞血酸和茚三酮，將容量瓶置于一定溫度下的水浴槽中，水浴反應一定時間。取出，迅速冷卻至室溫，用50%乙醇溶液定容至25 ml。用分光光度計在570 nm處測量溶液的吸光度，以試劑空白為參比。改變水浴溫度、水浴時間、茚三酮和抗壞血酸濃度，考察這些參數(shù)對吸光度的影響，選擇最佳的顯色反應條件。

1.2.2 工作曲線繪制

取30 mg甘氨酸溶解于冰醋酸中，并用冰醋酸定容至50 ml。取該溶液15 ml，用冰醋酸稀釋到50 ml，用1 mol/l醋酸鈉定容到100 ml。移取0.2～1.0 ml該溶液加入到25 ml的容量瓶中，在已確定的最佳顯色條件下顯色并測定其吸光度，繪制工作曲線。

1.2.3 甘氨酸亞鐵產(chǎn)品中游離甘氨酸的測定

稱取2.5 g甘氨酸亞鐵樣品加入至30 ml冰醋酸中，攪拌10 min，再浸漬10 min，減壓過濾，用20 ml冰醋酸分多次洗滌濾瓶。將濾液轉(zhuǎn)移到100 ml的容量瓶中，用1 mol/l的醋酸鈉定容。取1 ml該溶液加入到25 ml的容量瓶中在最佳顯色條件下顯色，測定其吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 顯色條件的選擇

2.1.1 最大吸收波長的確定

茚三酮與甘氨酸顯色后溶液呈現(xiàn)紫色，其可見吸收光譜如圖1所示。最大吸收波長在570 nm處，410 nm處雖也有強吸收峰，但因該吸收波長選擇性不高，故不予以采用[3]。

圖1 可見吸收光譜曲線

2.1.2 反應溫度的選擇

按1.2.1所述步驟，加入顯色劑茚三酮的濃度為0.6%(wt.%)，還原劑抗壞血酸的濃度為0.036%(wt.%)，分別將容量瓶置于30、50、60、75、90 ℃恒溫水浴槽中加熱10 min。考察顯色反應溫度對吸光度的影響，結(jié)果如圖2所示。由圖2可見，隨著反應溫度的升高，反應溶液的吸光度也逐漸增大，在75℃達到最大。因此，選擇75℃為最佳顯色反應溫度。

圖2 反應溫度對吸光度的影響

2.1.3 反應時間的選擇

按1.2.1所述步驟，加入顯色劑茚三酮的濃度為0.6%(wt.%)，還原劑抗壞血酸的濃度為0.036%(wt.%)，分別將容量瓶置于75℃的恒溫水浴槽中加熱5、8、10、12、15 min?？疾祜@色反應時間對吸光度的影響，結(jié)果如圖3所示。由圖3可見，隨著水浴加熱時間的延長，反應溶液的吸光度也逐漸增大，10 min達到最大后又開始下降。反應達15 min時，溶液的最大吸收波長發(fā)生藍移，從570 nm變?yōu)?67 nm（如圖4）。故最佳水浴時間確定為10 min。

圖3 反應時間對吸光度的影響

2.1.4 茚三酮用量的選擇

固定抗壞血酸的濃度為0.036%(wt.%)，顯色反應溫度為75℃，反應時間為10 min。考察顯色劑茚三酮濃度對吸光度的影響。由圖5可見，隨著茚三酮濃度的增加，溶液的吸光度也逐漸增加，濃度達到0.6%(wt.%)后上升趨勢變緩。因此，茚三酮的濃度確定為0.6%。

圖4 反應15 min的吸收光譜曲線

圖5 茚三酮用量對吸光度的影響

2.1.5 抗壞血酸用量的選擇

茚三酮與α-氨基酸的顯色反應有較多的副反應。為了得到紫色的主反應產(chǎn)物，需要加入一些還原劑抑制副反應的發(fā)生。通常的還原劑有氰化鈉、氯化亞錫和三氯化鈦等，這些還原劑有一定的毒性或會對環(huán)境有不良影響。文獻[3]采用抗壞血酸作還原劑獲得了較好的顯色效果，因此本文也用抗壞血酸做還原劑。

固定茚三酮的濃度為0.6%(wt.%)，顯色反應溫度為75℃，反應時間為10 min?？疾炜箟难釢舛葘ξ舛鹊挠绊?。由圖6可見，隨著抗壞血酸濃度的增加，溶液的吸光度也逐漸增大，濃度到達0.036%(wt.%)后吸光度變化很小。故抗壞血酸的最佳濃度選定為0.036%。

2.2 標準曲線

配制一系列不同濃度的甘氨酸溶液，在已確定的最佳實驗條件下測定其吸光度，獲得的工作曲線如圖7所示。吸光度與甘氨酸的濃度在0.75～3.75 μg/g呈線性關系，線性方程為A=0.148+0.071 7c（μg/g），相關系數(shù)R=0.994 2。

圖6 抗壞血酸用量對吸光度的影響

圖7 工作曲線

2.3 樣品的分析

2.3.1 游離甘氨酸與甘氨酸亞鐵的分離

茚三酮不但能與游離的甘氨酸發(fā)生反應，而且可以和甘氨酸亞鐵中的甘氨酸反應并促使甘氨酸亞鐵分解。因此，采用茚三酮作顯色劑測定甘氨酸亞鐵產(chǎn)品中的游離甘氨酸必須先把甘氨酸分離出來。從氨基酸螯合物產(chǎn)品中分離出游離氨基酸通常有凝膠過濾色譜法[4]和離子交換法[5]，然而這些方法操作繁瑣，實驗條件控制要求高。本文利用甘氨酸和甘氨酸亞鐵在冰醋酸中溶解度的差異來實現(xiàn)兩者的分離。

作者測定了25℃時甘氨酸和甘氨酸亞鐵在醋酸中的溶解度。結(jié)果顯示，甘氨酸的溶解度為440 mg/100 ml醋酸，而甘氨酸亞鐵的溶解度小于2 mg/100 ml醋酸。由于兩者的溶解度差異很大，可以通過溶解過濾的簡單辦法實現(xiàn)兩者的分離，具體過程參閱文獻[6]。

2.3.2 樣品的測試結(jié)果

按1.2.3所述步驟測定甘氨酸亞鐵產(chǎn)品中的游離甘氨酸含量，同時做加標回收實驗，測定結(jié)果如表1所示。同一樣品6次測定的RSD為2.32%，表明方法的精密度較好。在樣品中加入0.5、1.0和2.0 mg/g的分析純甘氨酸，回收率為95.4%～106.9%，表明該方法的準確度也較好。因此，該方法可以用于甘氨酸亞鐵產(chǎn)品中游離甘氨酸的測定。

3 小結(jié)

采用茚三酮分光光度法對甘氨酸亞鐵產(chǎn)品中游離甘氨酸含量進行了測定。最佳顯色條件為：茚三酮的濃度為0.6%，抗壞血酸濃度為0.036%，顯色反應溫度為75℃，顯色反應時間為10 min。在最佳條件下，工作曲線的線性范圍為0.75～3.75 μg/g，相關系數(shù)R=0.994 2。實際樣品測定結(jié)果的RSD為2.32%，加標回收實驗的回收率為95.4%～106.9%。該方法具有較高精密度和準確度，能夠滿足實際樣品分析檢測的要求。