路宏朝，王楊科，李麗霞，張 濤,2，李新生，王 琦,2,*

(1.陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723000；2.陜西省資源生物重點實驗室，陜西 漢中 723000；3.陜西省黑色有機食品工程技術(shù)研究中心，陜西 漢中 723000)

據(jù)古文獻記載，黑米具有滋陰補腎、健脾肝、明目活血之功效，因此黑米又有 “補血米”、“長壽米”的美稱[1]，其顏色由花青苷類物質(zhì)在米皮和胚乳上沉積而形成。黑米花青苷是花青啶與各種糖以糖苷鍵結(jié)合形成的糖苷，存在于黑稻的果實、莖、葉器官的細胞液中[2-3]，屬于黃酮多酚類化合物，具有多種營養(yǎng)和藥理作用[3-8]。Zhang Mingwei等[9]研究發(fā)現(xiàn)黑米的抗氧化作用與其中所含的黃酮和花青苷類物質(zhì)關(guān)系密切。錢松[10]研究發(fā)現(xiàn)黑米花色苷素對機體具有促進免疫的活性和重要的免疫調(diào)節(jié)作用。侯方麗等[11]研究發(fā)現(xiàn)，黑米花色苷能顯著降低CCl4肝損傷小鼠的肝酶活性，減輕對肝組織病理學(xué)損傷，表現(xiàn)明顯的護肝作用。因此，黑米花青苷作為一種較安全的天然色素資源，在食品和醫(yī)藥方面顯示出廣闊的應(yīng)用前景[12-13]。

本項目前期已研制出黑米花青苷復(fù)方膠囊[14]，為研究其在肝臟損傷中起到保護作用，通過建立小鼠CCl4肝損傷病理模型，采用該藥物進行治療，初步探索研究黑米花青苷復(fù)方膠囊在CCl4肝損傷中起到的防治效果。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

黑米花青苷復(fù)方膠囊由陜西省資源生物重點實驗室和陜西省黑色有機食品工程技術(shù)研究中心研制并提供，有效成分：黑米花青苷、二苯乙烯苷、菌多糖。低劑量：3.098mg/粒；高劑量： 88.339mg/粒[14]。助懸劑：大豆油。

昆明小鼠，體質(zhì)量18～22g，雄性，體質(zhì)健康，毛色光滑雪白，購買于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院(陜動字第08-005號)。

考馬斯亮藍試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、谷胱甘肽(GSH)試劑盒 南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒北京科盈美科技有限公司。

玻璃勻漿管、微量移液器 德國Eppendorf公司；臺式離心機 湘儀離心機儀器公司、N772可見分光光度計 上海精密科學(xué)儀器公司；680型酶標儀 美國伯樂公司；2215型石蠟切片機 德國徠卡公司；DP20奧林巴斯顯微鏡 日本奧林巴斯公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物及分組

將動物隨機分為6組：正常組、模型組、助懸劑Ⅰ組、助懸劑Ⅱ組、低劑量組、高劑量組，每組10只，置于通氣良好的室內(nèi)給予充足食物進行分籠飼養(yǎng)。

1.2.2 藥物配制

分別將低劑量藥物和高劑量藥物溶于蒸餾水，配制成質(zhì)量濃度為0.4mg/mL和0.6mg/mL的混合劑，0～4℃冷藏備用；將大豆油配制成質(zhì)量濃度為0.25mg/mL混合劑Ⅰ和0.15mg/mL的混合劑Ⅱ。

1.2.3 造模及給藥

采用CCl4造成肝損傷模型，分別給模型組、低劑量組、高劑量組每只小鼠腹腔注射20%的四氯化碳橄欖油0.1mL，2次/周。造模與給藥同時進行，正常組、模型組每天灌胃蒸餾水0.4mL，助懸劑Ⅰ組灌胃混合劑Ⅰ0.3mL，助懸劑Ⅱ組灌胃混合劑Ⅱ0.3mL，低劑量組灌胃低劑量藥物0.4mL(相當于7.57mg/(kg·d))，高劑量組灌胃高劑量藥物0.4mL(相當于10.60mg/(kg·d))。5周后，停止腹腔注射和灌藥，處死。

1.2.4 指標及測定

取肝臟制備肝組織勻漿液，檢測肝組織中蛋白質(zhì)含量、SOD活力、MDA、GSH和TNF-α水平，均按試劑盒說明操作。

1.2.5 肝臟病理學(xué)檢查

取肝組織用10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，HE染色，普通光鏡觀察。

1.3 數(shù)據(jù)處理

原始數(shù)據(jù)通過SPSS11.0 軟件中的ANOVA程序處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 肝組織勻漿生化指標檢測

表1 肝組織中SOD的活力和MDA的含量(±s，n= 10)Table 1 SOD activity and MDA content in liver tissue( ±s，n= 10)

表1 肝組織中SOD的活力和MDA的含量(±s，n= 10)Table 1 SOD activity and MDA content in liver tissue( ±s，n= 10)

注：a.與正常組比較，有顯著性差異(P＜0.05)，aa.與正常組比較，有極顯著性差異(P＜0.01)；b.與模型組比較，有顯著性差異(P＜0.05)；bb.與模型組比較，有極顯著性差異(P＜0.01)。下同。

組別 SOD活力/(U/mg pro) MDA含量/(nmol/mL)正常組 56.35±0.77 0.94±0.11模型組 48.13±7.22a 2.53±1.61aa助懸劑Ⅰ組 58.74±5.66b 2.19±0.40aabb助懸劑Ⅱ組 66.83±1.10aabb 1.84±0.63abb低劑量組 63.24±5.29abb 1.23±0.34bb高劑量組 66.75±6.49aabb 1.27±1.26bb

由表1可見，與正常組比較，模型組小鼠肝組織勻漿中SOD的活性顯著降低，MDA的含量顯著上升；而黑米花青苷復(fù)方膠囊低劑量和高劑量能顯著升高小鼠肝臟中SOD活性，降低MDA的含量；同時，兩助懸劑組相對于正常組，SOD活力和MDA的含量都有所提高。

表2 肝組織中GSH 的含量和TNF-α的水平(±s，n= 10)Table 2 GSH content and TNF-α level in liver tissue(±s，n= 10)

表2 肝組織中GSH 的含量和TNF-α的水平(±s，n= 10)Table 2 GSH content and TNF-α level in liver tissue(±s，n= 10)

組別 GSH含量/(mg/mL) TNF-α含量/(pg/mL)正常組 3.40±1.12 19.92±4.58模型組 2.66±0.97 20.17±5.58助懸劑Ⅰ組 2.63±0.70 15.54±2.82助懸劑Ⅱ組 2.84±0.36 16.01±1.56低劑量組 4.76±1.64abb 11.79±1.61aabb高劑量組 5.42±0.75aabb 4.78±3.39aabb

由表2可見，與正常組比較，模型組和兩助懸劑組的GSH和TNF-α含量較低，但無統(tǒng)計學(xué)意義。與模型組比較，高劑量和低劑量藥物都能極顯著升高小鼠肝臟中GSH的含量，降低TNF-α的水平。

2.2 肝組織病理變化

正常組肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)清楚，肝細胞條索明顯，無變性壞死、炎性細胞浸潤、纖維組織增生(圖1a)。模型組肝索排列雜亂無章，中央靜脈腫脹、充血。肝組織內(nèi)纖維結(jié)締組織大量增生，形成完整的假小葉，界限清楚。肝細胞腫脹、破裂，肝竇內(nèi)膽汁淤積，炎性細胞浸潤(圖1b)。助懸劑Ⅰ組和助懸劑Ⅱ組肝小葉結(jié)構(gòu)基本清晰，肝細胞結(jié)構(gòu)完整，無明顯變性(如圖1c、1d)。低劑量組肝索不明顯，纖維結(jié)締組織中度增生，形成不完整的假小葉，炎性細胞浸潤，肝細胞腫脹，胞質(zhì)內(nèi)可見大小不等、數(shù)量不一的脂肪空泡(圖1e)。高劑量組肝索排列有規(guī)律，纖維結(jié)締組織增生較輕，沒有形成完整的假小葉，肝細胞結(jié)構(gòu)較完整，炎性細胞浸潤和脂肪變性程度都比模型組、低劑量組低(圖1f)。

圖1 各實驗組小鼠肝臟組織形態(tài)(×100)Fig.1 Hepatic tissues of mice from different groups(×100)

3 討 論

CCl4是一種典型的肝臟毒物，是長期以來公認的復(fù)制肝損傷動物模型的化學(xué)物質(zhì)。許多研究認為CCl4復(fù)制的肝損傷可模擬病毒性肝損傷，其表現(xiàn)出來的癥狀、肝功能檢測指標、肝臟病理改變與病毒性肝炎具有相似性[15]。CCl4在體內(nèi)經(jīng)過藥物代謝酶的作用，如P-450微粒體酶系統(tǒng)，將CCl4去掉一個氯原子，而形成三氯甲烷，即氯仿，則成為肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和微粒體的藥物代謝酶系統(tǒng)的劇毒(產(chǎn)生三氯甲基自由基和氯自由基)，引起肝細胞生物膜的脂質(zhì)過氧化及肝細胞損害。本實驗采用腹腔注射0.1mL 20% CCl4的方法建立小鼠肝損傷模型，5周后，肝臟出現(xiàn)明顯的纖維化，形成假小葉，肝細胞腫脹、破裂，并伴有炎性細胞浸潤。說明本研究成功復(fù)制了小鼠CCl4實驗性肝損傷模型。

本實驗中，低劑量組和高劑量組小鼠肝臟中SOD的活力顯著升高，且隨著藥物濃度的增加而增強，表明黑米花青苷復(fù)方膠囊可提高機體清除自由基的能力。MDA含量的高低直接反應(yīng)肝臟中脂質(zhì)過氧化損傷程度。低劑量和高劑量組都能顯著降低肝臟中的MDA含量，說明黑米花青苷復(fù)方膠囊能夠有效防止肝細胞的脂質(zhì)過氧化。GSH是細胞內(nèi)重要的還原產(chǎn)物，機體產(chǎn)生過多的氧自由基能使GSH含量明顯下降[16]。本研究通過測定GSH含量來反映谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性的高低。結(jié)果表明，兩種劑量的黑米花青苷復(fù)方膠囊都可以顯著增加GSH的活性，由此可分析，黑米花青苷復(fù)方膠囊保肝作用可能與其抗氧化性有關(guān)，能夠提高SOD和GSH-Px的活性，清除自由基，阻止肝細胞脂質(zhì)過氧化，維持細胞質(zhì)膜的正常結(jié)構(gòu)，以降低肝細胞的損傷程度。TNF-α是肝損傷的一種重要炎癥因子，主要由激活的Kupffer細胞產(chǎn)生[17]。TNF-α也會引起許多與肝損傷有關(guān)的介質(zhì)如IL-1β的出現(xiàn)，同時誘導(dǎo)其他炎性介質(zhì)產(chǎn)生。另一方面，也可通過誘導(dǎo)氧自由基的產(chǎn)生及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、誘導(dǎo)NO產(chǎn)生、促進肝細胞凋亡等途徑引起肝細胞的損傷。在本實驗中，低劑量組、高劑量組TNF-α水平都顯著下降，說明兩藥物通過減輕炎癥反應(yīng)和阻止氧自由基的產(chǎn)生，對肝細胞起到保護作用。

病理組織學(xué)觀察，模型組小鼠肝臟出現(xiàn)明顯的纖維化，形成完整的假小葉，肝細胞腫脹、廣泛性壞死，并伴有嚴重的炎性細胞浸潤。低劑量和高劑量組癥狀都有所減輕，尤其高劑量組顯著地改善肝小葉變性、壞死的范圍和程度，減輕了炎性細胞的浸潤，進一步表明黑米花青苷復(fù)方膠囊對CCl4所致的肝損傷具有保護作用。

同時，兩助懸劑組與正常組比較，僅助懸劑Ⅱ組的SOD活力顯著升高，MDA的含量與助懸劑Ⅰ組比較有所降低，而對GSH含量和TNF-α水平?jīng)]有影響。組織學(xué)觀察，助懸劑組肝臟無明顯病變，說明它們不影響黑米花青苷復(fù)方膠囊的效果。因此，選用此助懸劑是較為安全的。

綜上所述，黑米花青苷復(fù)方膠囊對小鼠CCl4引起的肝損傷有較好的保護作用，具體機制的深入研究尚在進行中。

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