李 強(qiáng)，劉永樂(lè)*，王發(fā)祥，王滿(mǎn)生，俞 健，李向紅，王建輝

(長(zhǎng)沙理工大學(xué)食品與生物工程系，湖南 長(zhǎng)沙 410014)

草魚(yú)(Ctenopharyngodon idellus)又名鯇魚(yú)，屬鯉形目、鯉科、草魚(yú)屬，作為我國(guó)“四大家魚(yú)”之首，不僅食用品質(zhì)良好，而且鮮銷(xiāo)價(jià)格適中，深受消費(fèi)者歡迎[1]。草魚(yú)肌肉水分含量高約80%、蛋白質(zhì)含量約18%、脂肪含量約3%，是一種典型的高蛋白低脂肪食品，在貯藏、運(yùn)輸、加工處理及銷(xiāo)售過(guò)程中極易發(fā)生腐敗[2-4]，提高其貯藏性和貨架期一直是一個(gè)重要的課題。蛋白質(zhì)是魚(yú)類(lèi)肌肉組織的主要組成成分之一，其降解、聚合和變性都會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能的喪失，從而直接決定魚(yú)類(lèi)肌肉質(zhì)量的好壞。因此，在草魚(yú)肉的冷藏過(guò)程中，蛋白質(zhì)的降解和生化變化往往是魚(yú)肉鮮度下降、軟化并最終發(fā)生腐敗的重要原因之一。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)肌肉蛋白質(zhì)研究較多的淡水魚(yú)主要是鱸魚(yú)和鰱魚(yú)，且大都集中于蛋白質(zhì)的提取工藝、冷凍變性等方面，對(duì)其在貯藏過(guò)程中的變化研究較少[5-8]。現(xiàn)階段，研究者們多熱衷于對(duì)草魚(yú)保鮮技術(shù)方面的研究，往往忽視了有關(guān)草魚(yú)貯藏過(guò)程中的一些深層次生理生化變化，特別是對(duì)其肌肉蛋白質(zhì)在貯藏過(guò)程中的變化規(guī)律研究不多或了解甚少，因而盡管多種保鮮新技術(shù)[9-12]層出不窮，但仍無(wú)法有效阻止草魚(yú)肉的鮮度下降和腐敗。本實(shí)驗(yàn)以新鮮草魚(yú)為原料，研究草魚(yú)肌肉蛋白質(zhì)在冷藏過(guò)程中的組成特性變化，從蛋白質(zhì)變化角度闡述草魚(yú)肉在貯藏過(guò)程中鮮度變化機(jī)理，旨在為針對(duì)性開(kāi)展新鮮草魚(yú)的保鮮及開(kāi)發(fā)相應(yīng)產(chǎn)品提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

新鮮草魚(yú)購(gòu)自當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)，每尾約1.5kg。

標(biāo)準(zhǔn)蛋白 加拿大Fermentas公司；牛血清蛋白上海澤龍生物工程有限公司；其他試劑均為分析純。

UV-2100紫外分光光度計(jì) 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；5430R高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；JYL-C012絞肉機(jī) 九陽(yáng)股份有限公司；DYCZ-24DN電泳儀 北京六一儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 魚(yú)肉樣品制備

鮮活草魚(yú)于冰水中暫養(yǎng)1～2h，放血后去頭、鱗和內(nèi)臟，用預(yù)冷水清洗干凈后剔除魚(yú)骨，將背部肌肉分割成大小均勻的小塊(約25g)，置于4℃冰箱中，備用。分別取冷藏時(shí)間為0、2、4、6、8、10d的魚(yú)塊于絞肉機(jī)內(nèi)絞碎，即為實(shí)驗(yàn)魚(yú)肉樣品。

1.2.2 不同溶解性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

取一支50mL的離心管，精確稱(chēng)取約2g 樣品(精確至0.01g)，加入蒸餾水18mL，均質(zhì)1min，25℃浸提1h，5000×g離心15min，將上清液轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，重復(fù)操作1次，合并上清液，并定容至50mL，所得樣品即為水溶性蛋白溶液。如此將沉淀依次用鹽(0.5mol/L NaCl溶液)、酸(pH 2.0鹽酸溶液)、堿(pH12 NaOH溶液)浸提，所得上清液即分別為鹽溶性蛋白、酸溶性蛋白、堿溶性蛋白。以微量凱氏定氮法測(cè)定其蛋白質(zhì)含量。

1.2.3 不同結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

參考Hashimo等[13]的方法，并稍作修改。精確稱(chēng)取約2g樣品(精確至0.01g)與20mL磷酸鹽緩沖液A(含15.6 mmol/L Na2HPO4、3.5mmol/L NaH2PO4，pH7.5)混合，均質(zhì)20s左右，浸提0.5h，5000×g離心15min，沉淀加入20mL磷酸緩沖液A(含0.5mol/L NaCl)，重復(fù)上述操作，將2次離心后的上清液合并，加入三氯乙酸(TCA)，使TCA的終濃度達(dá)50g/L后離心，所得沉淀即為肌漿蛋白樣品。經(jīng)緩沖液A提取2次后所得的沉淀中加入20mL磷酸鹽緩沖液B，均質(zhì)20s左右，浸提0.5h，5000×g離心15min，再在沉淀中加入20mL磷酸鹽緩沖液B，重復(fù)上述操作，將2次離心后的上清液合并，即為肌原纖維蛋白樣品。在沉淀中加入0.1mol/L NaOH溶液，均質(zhì)，浸提2h，5000×g離心15min，所得沉淀即為肌基質(zhì)蛋白樣品。肌原纖維蛋白采用雙縮脲法進(jìn)行定量測(cè)定；肌漿蛋白和肌基質(zhì)蛋白則采用微量凱氏定氮法測(cè)定。

1.2.4 肌肉中總蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析

準(zhǔn)確稱(chēng)取肌肉樣品2g(精確至0.01g)，加入20mL 20g/L SDS的溶液，均質(zhì)，浸提0.5h，5000×g離心15min，收集上清液；準(zhǔn)確吸取上清液200μL于1.5mL Eppendorf管中，加入等體積的上樣緩沖液，于沸水中煮沸5min，然后10000×g離心5min，所得上清液即為待電泳樣品。電泳用分離膠濃度為12%，采用恒流23mA進(jìn)行電泳分離。用0.5g/L的考馬斯亮藍(lán)R250染色2～3h，然后脫色至背景透明，照相并分析電泳條帶[14-17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 草魚(yú)肌肉冷藏過(guò)程中不同溶解性蛋白質(zhì)含量的變化

圖1 草魚(yú)肌肉冷藏過(guò)程中不同溶解性蛋白質(zhì)含量的變化Fig.1 Change in contents of proteins with different solubility during chill storage of grass carp muscle

由圖1可知，冷藏前4d，水溶性和酸溶性蛋白含量基本未變，鹽溶性蛋白含量稍有減少，堿溶性蛋白含量略有增加，可能是因?yàn)槔洳厍捌谖⑸镒饔檬艿揭种?，肌肉組織內(nèi)源酶的作用對(duì)蛋白質(zhì)的降解有限。隨著冷藏時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，水溶性蛋白含量顯著增加，鹽溶性蛋白含量也明顯上升，但酸溶性和堿溶性蛋白含量在逐漸降低，這可能是因?yàn)槔洳?d后，一方面內(nèi)源組織酶持續(xù)作用于肌肉蛋白質(zhì)的效果得以積累，另一方面微生物繁殖和活動(dòng)引入大量外源性蛋白酶，從而導(dǎo)致大分子蛋白質(zhì)組分持續(xù)降解，從而改變了其溶解性。此外，冷藏第8天后，鹽溶性蛋白含量明顯減少，可能是因?yàn)榇藭r(shí)酸、堿溶性蛋白組分已基本徹底降解，不再或很少轉(zhuǎn)變?yōu)辂}溶性部分，但鹽溶性蛋白還在繼續(xù)變化為水溶性蛋白。

2.2 草魚(yú)肌肉冷藏過(guò)程中不同結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的變化

魚(yú)肌肉蛋白質(zhì)可以分為肌原纖維蛋白(約占60%～75%)、肌漿蛋白(約占20%～35%)和肌基質(zhì)蛋白(約占2%～5%)3類(lèi)[18]。冷藏過(guò)程中草魚(yú)肌肉中3類(lèi)不同結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的含量變化情況如圖2所示?？梢?jiàn)，冷藏前4d，3類(lèi)蛋白質(zhì)的含量變化較??；至第4天后，肌原纖維蛋白含量開(kāi)始顯著降低，但肌漿蛋白和肌基質(zhì)蛋白僅稍有下降，說(shuō)明冷藏過(guò)程中，發(fā)生降解的蛋白質(zhì)組分主要是肌原纖維蛋白，如肌球蛋白等。實(shí)際上，肌原纖維蛋白的數(shù)量和完整性(分子大小分布)與魚(yú)肉的質(zhì)構(gòu)、彈性、持水力及所有與其品質(zhì)有關(guān)的特征直接相關(guān)，而冷藏過(guò)程中內(nèi)、外源蛋白酶和許多代謝性蛋白質(zhì)的作用加速了其降解，從而導(dǎo)致魚(yú)肉軟化和腐敗[19]。

圖2 草魚(yú)肌肉冷藏過(guò)程中不同結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)含量變化Fig.2 Changes in contents of proteins with different structure during chill storage of grass carp muscle

圖3 草魚(yú)肌肉冷藏過(guò)程中各蛋白質(zhì)含量變化幅度Fig.3 Reduction in contents of different molecular proteins during chill storage of grass carp muscle

由圖3可知，草魚(yú)肌肉冷藏過(guò)程中3類(lèi)不同結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)在冷藏過(guò)程中一直在降解，但相對(duì)于肌漿蛋白和肌基質(zhì)蛋白，肌原纖維蛋白隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)，其含量下降的程度越明顯，這除了肌肉組織蛋白酶主要作用于肌原纖維蛋白外，也可能與其含量占整個(gè)肌肉蛋白質(zhì)比例最大有關(guān)。同時(shí)也說(shuō)明隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)，草魚(yú)肌肉組織蛋白質(zhì)降解程度增加，魚(yú)肉鮮度下降或腐敗現(xiàn)象越嚴(yán)重。

2.3 草魚(yú)肌肉冷藏過(guò)程中肌肉總蛋白的SDS-PAGE分析

圖4 草魚(yú)肌肉冷藏過(guò)程中總蛋白SDS-PAGE圖譜Fig.4 SDS-PAGE pattern of total muscular proteins in grass carp during chill storage of grass carp muscle

由圖4可知，新鮮草魚(yú)樣品(0d)在SDS-PAGE圖譜上可清晰分辨出20～30條蛋白帶，其中主要條帶為肌球蛋白重鏈(MHC，210kD)、肌動(dòng)蛋白(actin，42kD)、原肌球蛋白(α-或β-tropomyosin，35kD)以及3種肌球蛋白輕鏈(MLC，15、17、24kD)，另外還有一些分子質(zhì)量20～40kD間的明顯蛋白條帶。冷藏 2d 后，所有蛋白條帶的信號(hào)較 0d 的樣品均有所下降，表明冷藏過(guò)程中各種蛋白質(zhì)均會(huì)降解；冷藏第8天時(shí)，210kD的肌球蛋白重鏈等大分子蛋白條帶幾乎完全消失，分子質(zhì)量為17、15kD的肌球蛋白輕鏈(MLC2和MLC3)及其他小分子蛋白條帶也基本消失，表明這些蛋白在冷藏后期極易降解。有趣的是，冷藏第8天后的泳道新增了一條大于85kD的新蛋白條帶，可能為大分子蛋白質(zhì)降解后的中間體，也可能為某些小分子蛋白質(zhì)的寡聚體?？梢?jiàn)，42kD的肌動(dòng)蛋白和24kD的肌球蛋白輕鏈(MLC1)相對(duì)比較穩(wěn)定，10d時(shí)仍有明顯的條帶存在，但降解仍超過(guò)50%。此外，部分30～40kD的蛋白質(zhì)如原肌球蛋白似乎比較穩(wěn)定，冷藏10d其蛋白條帶的信號(hào)變化不明顯，這與張凌晶等[6]研究鰱魚(yú)肌肉蛋白質(zhì)的結(jié)果基本一致。

3 討論與結(jié)論

淡水魚(yú)在冷藏過(guò)程中鮮度下降、軟化并最終發(fā)生腐敗主要是因?yàn)槊复呋瘜?dǎo)致的肌肉內(nèi)部組分的生理生化變化，而蛋白質(zhì)為肌肉組織的主要組成部分，其降解、聚合和變性都會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能的喪失，從而直接決定魚(yú)肌肉質(zhì)量的好壞。本實(shí)驗(yàn)對(duì)冷藏過(guò)程中草魚(yú)肌肉中總蛋白質(zhì)、不同溶解性蛋白組分和不同結(jié)構(gòu)蛋白組分的變化情況進(jìn)行了分析，結(jié)果表明：冷藏過(guò)程中草魚(yú)肌肉蛋白質(zhì)在逐漸發(fā)生降解，至第6～8天后肌球蛋白重鏈等大分子質(zhì)量蛋白質(zhì)降解加速，幾乎完全消失(圖4)。冷藏過(guò)程中，肌原纖維蛋白在內(nèi)源酶的作用下逐漸降解，第 4～6天開(kāi)始含量顯著降低(圖2)，導(dǎo)致魚(yú)體組織軟化，水溶性蛋白含量增加(圖1)，這又為微生物的生長(zhǎng)提供了營(yíng)養(yǎng)，從而不斷增殖和活動(dòng)并引入大量外源酶作用，造成其他蛋白質(zhì)的進(jìn)一步降解，最終導(dǎo)致魚(yú)肉品質(zhì)劣化和腐敗。

蛋白質(zhì)降解是魚(yú)肉腐敗的重要表現(xiàn)[20]，分析淡水魚(yú)肌肉蛋白質(zhì)的變化是深入研究其腐敗機(jī)理的重要手段，對(duì)針對(duì)性提出淡水魚(yú)肉保鮮研究具有重要指導(dǎo)意義。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)與腐敗有關(guān)的具體蛋白質(zhì)的降解細(xì)節(jié)和變化規(guī)律研究不多，了解甚少。本實(shí)驗(yàn)探討了草魚(yú)冷藏過(guò)程中肌肉蛋白質(zhì)的組成特性變化，為研究淡水魚(yú)低溫貯藏過(guò)程中的肌肉蛋白質(zhì)降解規(guī)律提供了部分生物學(xué)證據(jù)。然而，需要指出的是，本實(shí)驗(yàn)是以草魚(yú)背部肌肉小塊為研究對(duì)象，因此，其冷藏過(guò)程中蛋白質(zhì)的降解情況可能與完整草魚(yú)的降解情況存在差異；另外，不同魚(yú)體或不同部位的個(gè)體差異在今后的研究中也值得考慮。

草魚(yú)肌肉冷藏過(guò)程中不同溶解性蛋白質(zhì)變化趨勢(shì)有所不同，冷藏第4天為變化的重要時(shí)間點(diǎn)，水溶性蛋白含量開(kāi)始顯著增加，酸、堿溶性蛋白含量開(kāi)始減少，鹽溶性蛋白含量則先小幅增加至第8天開(kāi)始下降；冷藏過(guò)程中3種不同結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的含量也均有所下降，其中肌原纖維蛋白自第4天開(kāi)始顯著降低，而肌漿蛋白和肌基質(zhì)蛋白則相對(duì)穩(wěn)定，含量減低幅度較小。此外，冷藏過(guò)程中肌肉總蛋白質(zhì)也在不斷降解，至第6～8天降解加速，肌球蛋白重鏈等大分子質(zhì)量蛋白質(zhì)完全消失。

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