廣東省醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所三水中心（佛山 528137）

PVC 體外循環(huán)血路是尿毒癥患者及腎病患者在血液透析時(shí)所必須使用的醫(yī)療器械產(chǎn)品。PVC室溫下較硬且易碎，需要加入增塑劑以改善其柔韌性，目前最常用的增塑劑是鄰苯二甲酸二異辛酯（簡(jiǎn)稱DEHP）。研究表明，循環(huán)血路在使用過程中，增塑劑會(huì)溶出而進(jìn)入人體[1]。動(dòng)物試驗(yàn)研究表明DEHP 具有廣泛的不良反應(yīng)，明顯表現(xiàn)為肝臟毒性和睪丸萎縮[2]。美國(guó)、日本建議在某些人群和一些特殊用途時(shí)不要使用含DEHP 的PVC醫(yī)療產(chǎn)品，歐盟更將其列入首批SVHCs（高度關(guān)注物質(zhì)）名單中[3]。我國(guó)在《一次性使用輸注器具產(chǎn)品注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則》（簡(jiǎn)稱《指導(dǎo)原則》）中也指出增塑劑不再局限于DEHP,更安全的醫(yī)用增塑劑可以使用。

偏苯三酸三辛酯（簡(jiǎn)稱TOTM/TEHTM）是目前DEHP 替代物之一，使用在PVC 體外循環(huán)血路中。雖然TOTM 具有生物體內(nèi)代謝快，潛在毒性低[4,5]，耐高溫、低浸出[6]等優(yōu)良特性，但《指導(dǎo)原則》中要求“非DEHP 增塑的PVC 醫(yī)療器械，需提交該增塑劑用于人體的安全風(fēng)險(xiǎn)分析報(bào)告”。本文擬通過模擬臨床使用方式制備檢驗(yàn)液，采用高效液相色譜測(cè)定循環(huán)血路中TOTM 的溶出量，并根據(jù)TOTM 的不良反應(yīng)水平推導(dǎo)出其每日允許限量來評(píng)價(jià)使用TOTM 循環(huán)血路的安全性。

1.試驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

LC-20AT 高效液相色譜儀（日本島津，配PDA 檢測(cè)器）；

UV-2550 紫外分光光度計(jì)（日本島津）

分析天平（精度為0.1mg）；

液體比重天平

恒溫水浴鍋；

滾壓式血泵/離心泵。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和樣品

無水乙醇：體積分?jǐn)?shù)99.7%，密度ρ 為0.789g/ml～0.791g/ml；

浸提溶劑：用液體比重天平配置密度ρ 為（0.9373～0.9378）g/mL 的乙醇水混合液；

偏苯三酸三辛酯：優(yōu)級(jí)純，純度98%，密度0.98g/cm3，折光率n20/D：1.485～1.487 ；

人工心肺機(jī)－體外循環(huán)血路樣品（采用TOTM 為增塑劑）。

圖1.TOTM紫外吸收譜圖

1.3 色譜條件

色譜柱：島津Inertsil ODS-SP C18 反相色譜柱(4.6×150mm，5μm， 配C18 保護(hù)柱)

檢測(cè)器溫度：40?C；

檢測(cè)波長(zhǎng)：220nm；

流動(dòng)相：甲醇；

流速：1ml/min；

進(jìn)樣量：10μL。

1.4 浸提溶劑

TOTM 是一種無色透明的油狀液體，微溶于水， 25?C 水中溶解度為0.13mg/L,可溶于醇、醚、酮等大多數(shù)有機(jī)溶劑。雖然體外循環(huán)血路與人體接觸的是血液，但是由于血液來源受到限制，所以必須選用其他的浸提溶劑。本文參考DEHP 常用浸提介質(zhì)—（0.9373～0.9378）g/mL 乙醇水溶液來浸提出TOTM。

1.5 樣品前處理

根據(jù)產(chǎn)品的臨床使用條件進(jìn)行模擬試驗(yàn)來制備檢驗(yàn)液。對(duì)于人工心肺機(jī)體外循環(huán)血路其臨床使用時(shí)間一般為6h，本試驗(yàn)以12h 為檢驗(yàn)液制備時(shí)間。取體外循環(huán)管路一套，按說明書的要求與泵連接，將管路的入液口和出液口插入到一個(gè)2L 的加蓋容器中以形成一個(gè)密閉的回路。將2L 的浸提溶劑注入到容器中。然后將帶有浸提介質(zhì)的容器置入到37±1?C 的水浴鍋中。打開泵，將流速調(diào)至2L/min，使浸提溶液開始循環(huán)，在37±1?C 下循環(huán)，取循環(huán)1h、3h、6h、12h 時(shí)的浸提液，作為供試液。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線

在乙醇中溶解0.1000gTOTM，用乙醇稀釋至100ml，得溶液1，再精密移取1mL 溶液1 至10mL 容量瓶中，用浸提溶劑定容至10mL,制得10μg/mL TOTM 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

分別精密移取TOTM 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液0.5、0.5、1、2、5、10、25mLTOTM 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100mL、50ml、50ml、50ml、50ml、50ml、50ml 容量瓶中，用浸提溶劑定容，配成濃度為0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，經(jīng)0.45μm 過濾頭過濾，按以上色譜條件進(jìn)樣，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定三次，分別以峰面積平均值與各對(duì)應(yīng)濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 含量測(cè)定方法

1.7.1 吸收波長(zhǎng)的選擇

以ρ 為（0.9373～0.9378）g/mL 的乙醇水混合液為參比，掃描TOTM 標(biāo)準(zhǔn)溶液在200nm～320nm的紫外吸收，圖1 表明TOTM 在200nm～250nm之間吸收較強(qiáng)，選取220nm 為液相色譜PDA 檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.7.2 TOTM 的含量測(cè)定

取浸提液，經(jīng)0.45μm 過濾頭過濾,得檢驗(yàn)液，按以上色譜條件進(jìn)行液相色譜分析，色譜圖見圖2，TOTM 出峰時(shí)間為5.600min。

圖2.TOTM液相色譜圖

2.結(jié)果分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 線性范圍及檢測(cè)限

TOTM 在0.05～5.0μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為y=16959x+232.34，R2=0.9998。檢測(cè)限為0.0110μg/mL。

2.1.2 加標(biāo)回收率及精密度

被測(cè)樣品中分別精密加入濃度為0.0600μg/mL、0.0800μg/mL、0.1000μg/mL 的TOTM 標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，每個(gè)樣品測(cè)試6次，計(jì)算平均回收率。表1 中結(jié)果表明該方法的準(zhǔn)確度較高，回收率為95.9%～98.7%，RSD 為0.12%～0.35%。

2.2 TOTM 允許限量（AL）

根據(jù)日本OECD SIDS 數(shù)據(jù)[7]，以大鼠試驗(yàn)，TOTM 的重復(fù)劑量毒性和生殖毒性（雄性）是最大的，其不良反應(yīng)水平(NOAEL)都為100mg/kg bw/day，而雌性及后代的生殖毒性為1000mg/kg bw/day，因此一般以雄性生殖毒性來研究TOTM安全性研究的毒性特征。TOTM 允許限量依據(jù)GB/T16886.17-2005《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第17部分：可瀝濾物允許限量的建立》進(jìn)行推導(dǎo)。

2.2.1 可耐受攝入量(TI)

UF1— 表示人體間的個(gè)體差異，根據(jù)動(dòng)物對(duì)毒性試劑的安全評(píng)估，選用缺省值10

UF2— 表示從替代物種數(shù)據(jù)的推導(dǎo)而不是人類數(shù)據(jù)，參考FDA 推導(dǎo)DEHP 時(shí)的值3

UF3— 表示實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的定性和相關(guān)性，本試驗(yàn)有缺乏支持性研究、終點(diǎn)評(píng)估中不適當(dāng)動(dòng)物模型的使用以及不適當(dāng)?shù)慕佑|途徑等不確定因子，因此設(shè)定為3。

表1.回收率測(cè)定結(jié)果（n=6）

表2.各時(shí)間段TOTM 溶出量

圖3.TOTM溶出量隨時(shí)間的變化

2.2.2 TOTM 可耐受限量(TE)

TE=TI×m×UTF UTF=CEF×PEF

m— 醫(yī)療器械接觸群體的體質(zhì)量，成人默認(rèn)值為70kg

CEF— 多器械接觸因子，取缺省值0.2

PET— 比例接觸因子，取缺省值1

TE=1.11 mg/kg bw/day×70 kg×0.2×1=15.54 mg/day

2.2.3 TOTM 允許限量的確立

允許限量即可瀝濾物通過醫(yī)療器械接觸進(jìn)入人體時(shí)，認(rèn)為每天可接受的最大量，即判斷TOTM 的每天能接受的最大量。

AL=TE×BF

BF— 為受益因子，因體外循環(huán)管中TOTM的溶出量在技術(shù)和經(jīng)濟(jì)上都是可行的，因此不進(jìn)行受益評(píng)價(jià)，受益因子設(shè)為1。

AL=TE=15.54 mg/ day

2.3 TOTM 溶出量分析

取1h、3h、6h、12h 時(shí)的供試液，按以上色譜條件檢測(cè)， TOTM 浸出量隨時(shí)間的變化見圖3 所示。

由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果知，體外循環(huán)血路浸出濃度在0.0534～0.0601μg/mL 之間，可能是因?yàn)槿艹隽繚舛容^低，造成取樣濃度不均勻，有以上的趨勢(shì)圖，總體溶出量還是呈比較平緩的上升趨勢(shì)，浸提12h 的檢驗(yàn)液TOTM 溶出量為0.0601μg/mL，2L 浸提液中TOTM 溶出總量可通過以下式計(jì)算可得：

總?cè)艹隽?mg)=0.0601μg/mL×2000 mL=120.2μg

由結(jié)果可以看出，浸提12h 后，體外循環(huán)管總?cè)艹隽繛?20.2μm，即人體可能接觸到的TOTM 為0.1201mg/12h,遠(yuǎn)小于上述推導(dǎo)出的TOTM 允許限量15.54 mg/ day，在安全限量范圍內(nèi)。

3.總結(jié)

TOTM 作為一種新型的具有潛力的環(huán)保增塑劑，其大量的使用必然要求對(duì)其溶出量進(jìn)行測(cè)定和安全性評(píng)估，本文采用高效液相色譜法測(cè)定TOTM 溶出量，具有準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。而TOTM 允許限量的建立涉及支持性研究、不適當(dāng)動(dòng)物模型等不確定因素，因此本文允許限量的建立僅適用于本試驗(yàn)產(chǎn)品。本試驗(yàn)中TOTM 溶出量是以乙醇水溶液為浸提介質(zhì)，與臨床使用血液作為浸提介質(zhì)的差別還有待考究。另外，試驗(yàn)中浸提時(shí)溶劑的循環(huán)速度對(duì)溶出量有較大的影響，循環(huán)速度大小和溶出量的關(guān)系尚待進(jìn)一步的研究。

[1]盧忠,胡相華,何小帆.在體外循環(huán)血路行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中增加常用化學(xué)粘合劑殘留量檢測(cè)的建議及檢測(cè)方法設(shè)計(jì).中國(guó)醫(yī)療器械信息 16,48-50(2010).

[2]FDA.Safety assessment of di(2-ethylhexyl)phthalate(DEHP)released from PVC medical devices.Center for Devices and Radiological Health,US Food and Drug Administration,Rockville.http://www.fda.gov/cdrh/ost/dehp-pvc.pdf(2001).

[3]楊曉冬.PVC 醫(yī)療器械中增塑劑DEHP 的安全性評(píng)價(jià).中國(guó)醫(yī)療器械雜志 36,118-120(2012).

[4]K.Kambia,T.Dine,R.Azar,et .Comparative study of the leachability of di(2-ethylhexyl)phthalate and tri(2-ethylhexyl)trimellitate from haemodialysis tubing.International journal of pharmaceutics 229,139-146(2001).

[5]European commission.Opinion on the safety of medical devices containing DEHP-plasticized PVC or other plasticizers on neonates and other groups possible at risk.Health &Consumer Protection Directorate-General(2008).

[6]Raumedic AG.Migration of platicizers from PVC tubes into contact media.Fraunhofer Institute for Process Engineering and Packaging IVV,1-13(2010).

[7]OECD SIDS.SID Initial Assessment Report for SIAM14.UNEP PUBLICATIONS,1-118(2002).