葉勁松

合肥學(xué)院生物與環(huán)境工程系 合肥 230601

環(huán)境微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)進(jìn)展

葉勁松

合肥學(xué)院生物與環(huán)境工程系 合肥 230601

光學(xué)顯微鏡是環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行顯微觀察所必不可少的基本儀器手段。簡(jiǎn)介光學(xué)顯微鏡的發(fā)展歷程，重點(diǎn)介紹突破光學(xué)分辨率技術(shù)的最新光學(xué)顯微鏡研制進(jìn)展；圍繞顯微鏡實(shí)驗(yàn)教學(xué)技術(shù)模式，對(duì)于最新的數(shù)碼顯微互動(dòng)系統(tǒng)和對(duì)可替代部分真實(shí)顯微鏡的虛擬仿真顯微鏡系統(tǒng)進(jìn)行簡(jiǎn)介及展望。

環(huán)境微生物學(xué)；實(shí)驗(yàn)技術(shù)；光學(xué)顯微鏡

10.3969/j.issn.1671-489X. 2013.18.128

作者：葉勁松，實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)榄h(huán)境微生物學(xué)。

環(huán)境微生物學(xué)是建立在實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上的操作性很強(qiáng)的一門(mén)學(xué)科。在環(huán)境微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常使用的儀器為光學(xué)顯微鏡和高壓滅菌鍋。其中，光學(xué)顯微鏡是進(jìn)行顯微觀察所最不可少的基本儀器和手段，對(duì)于光學(xué)顯微鏡尤其是突破其光學(xué)分辨率上限的研究一直是熱點(diǎn)。另外，隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)發(fā)展，以顯微鏡為主要工具手段的實(shí)驗(yàn)教學(xué)模式技術(shù)也在不斷變革之中，新的教學(xué)模式技術(shù)直接推動(dòng)了顯微鏡實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果的增強(qiáng)。相對(duì)于顯微鏡來(lái)說(shuō)，高壓滅菌鍋除了從手動(dòng)升級(jí)為自動(dòng)之外，其它并無(wú)大的變化。故本文主要從光學(xué)顯微鏡發(fā)展及其教學(xué)模式技術(shù)革新的視角，對(duì)環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)展開(kāi)綜述。

1 光學(xué)顯微鏡的發(fā)展

1.1 光學(xué)顯微鏡的研發(fā)歷程

自光學(xué)顯微鏡發(fā)明以來(lái)，它的每一步發(fā)展都直接推動(dòng)人類對(duì)微觀世界的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)。1590年左右，荷蘭眼鏡商Janssen父子發(fā)明了原始的光學(xué)顯微鏡（不超過(guò)10倍）。1665年，Robert Hooke用其制造的初具現(xiàn)代光學(xué)顯微鏡雛形的顯微鏡，第一次觀測(cè)到軟木塞中的“cella”（細(xì)胞壁，放大40～140倍）；1680年，荷蘭人Anton van Leeuwenhoek用其制造的約300倍的顯微鏡第一次觀察到細(xì)菌和原生動(dòng)物[1]。

Leeuwenhoek去世后，顯微鏡研究進(jìn)展緩慢。1752年，英國(guó)人J. Dollond發(fā)明消色差顯微鏡。1812年，蘇格蘭人D. Brewster發(fā)明油浸物鏡，并改進(jìn)了體視顯微鏡。1873年，德國(guó)物理學(xué)家Ernst Abbe[2]揭示了遠(yuǎn)場(chǎng)光學(xué)顯微鏡由于光存在衍射效應(yīng)，預(yù)言了“阿貝極限”存在，即普通光學(xué)顯微鏡分辨力極限約為200 nm[3]。13年后的1886年，Abbe發(fā)明了復(fù)消差顯微鏡并改進(jìn)了油浸物鏡，至此，普通光學(xué)顯微鏡技術(shù)基本成熟。1904年后，又先后有熒光顯微鏡、干涉顯微鏡、相位差顯微鏡和Nomarski干涉相位差顯微鏡等特種光學(xué)顯微鏡問(wèn)世[1]。

1984年，第一臺(tái)商品化的共聚焦顯微鏡（型號(hào)為SOM-100）投入使用。多數(shù)共聚焦顯微鏡所用光源為激光，成像方式為逐點(diǎn)掃描成像，因此又被稱為激光掃描共聚焦顯微鏡。目前，德國(guó)LEICA公司的LEICA TCS SP2顯微鏡分辨率可達(dá)到180 nm。

1.2 突破光學(xué)分辨率極限的光學(xué)顯微鏡

自Abbe后的一個(gè)多世紀(jì)，200 nm的“阿貝極限”一直被認(rèn)為是光學(xué)顯微鏡理論分辨力極限。此后提高光學(xué)分辨率工作一度停滯不前，小于這個(gè)尺寸的物體須借助電子顯微鏡或掃描隧道顯微鏡才能觀察。

但是近年來(lái)提高分辨率有了較大進(jìn)展，突破“阿貝極限”的光學(xué)顯微鏡相繼問(wèn)世。在20世紀(jì)80年代研發(fā)的近場(chǎng)光學(xué)顯微鏡（SNOM，Scanning Near-field Optical Microscope）的出現(xiàn)，是對(duì)于普通光學(xué)顯微鏡的首次革命。它不用光學(xué)透鏡成像而是利用近場(chǎng)光學(xué)原理，借鑒掃描隧道顯微鏡（STM）掃描探針技術(shù)，在樣品表面上方掃描獲得表面信息[4]。1984年，瑞士IBM研究中心用金屬鍍膜的石英晶體尖端制成的納米尺寸光孔作為探針，制成世界上第一臺(tái)近場(chǎng)光學(xué)顯微鏡。同時(shí)，美國(guó)康乃爾大學(xué)用微毛細(xì)管拉成溝極細(xì)光孔為探針，制成近場(chǎng)光學(xué)顯微鏡。從此，近場(chǎng)光學(xué)顯微鏡廣泛應(yīng)用于各種微觀觀測(cè)領(lǐng)域[5]。目前的近場(chǎng)光學(xué)顯微鏡，所報(bào)道的分辨率已達(dá)λ/20～λ/40[6]。近場(chǎng)光學(xué)顯微鏡在納米尺度光學(xué)觀察上起到其他掃描探針顯微鏡和原子力顯微鏡所不能取代的作用[7]。

近場(chǎng)光學(xué)顯微鏡與傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的最大區(qū)別在于：以納米級(jí)光學(xué)探針代替?zhèn)鹘y(tǒng)光學(xué)鏡頭；樣品表面近場(chǎng)區(qū)域內(nèi)存在攜帶表面精細(xì)結(jié)構(gòu)信息的非輻射場(chǎng)，探針被控制于樣品表面一個(gè)波長(zhǎng)以內(nèi)的近場(chǎng)區(qū)域內(nèi)，可探測(cè)到亞微米級(jí)光學(xué)信息。這樣就突破了“阿貝極限”的限制，理論上其分辨率是無(wú)限大的。NSOM的分辨率不依賴于光的波長(zhǎng)，使其成為真正意義上的光學(xué)顯微鏡[8]。由于探針尖不能做得無(wú)限小和不能無(wú)限接近樣品，實(shí)際分辨率是有限的[9]。近場(chǎng)光學(xué)顯微鏡能克服傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡低分辨率以及掃描電子顯微鏡和掃描隧道顯微鏡對(duì)生物樣品產(chǎn)生損傷等缺點(diǎn)，且能進(jìn)行高分辨率光學(xué)成像，因此被廣泛應(yīng)用于生物樣品的觀察[10]。

1994年，德國(guó)人Stefan Hell巧妙地借助脈沖激光的作用，也突破了“阿貝極限”。他發(fā)明的新型光學(xué)顯微鏡STED（受激發(fā)射損耗），分辨率已達(dá)到50～70 nm，且理論上還能提高數(shù)倍（據(jù)稱能夠觀察20 nm左右的微小生物）[11]。2011年3月1日，英國(guó)和新加坡研究人員報(bào)道他們制造出能夠觀測(cè)50 nm大小物體的光學(xué)顯微鏡，這是迄今觀測(cè)能力最強(qiáng)的光學(xué)顯微鏡，也是世界上第一個(gè)能在普通白光照明下直接觀測(cè)納米級(jí)物體的光學(xué)顯微鏡。而且從理論上說(shuō)，他們這種基于“透明微米球透鏡”的光學(xué)顯微鏡不存在觀測(cè)極限。

光學(xué)顯微鏡的世界品牌有奧林巴斯、尼康、蔡司和徠卡，這4家公司壟斷了世界高端光學(xué)顯微鏡市場(chǎng)，各自擁有自己的獨(dú)特技術(shù)。國(guó)產(chǎn)顯微鏡中，麥克奧迪是第一品牌，在國(guó)外也開(kāi)始有了一定的知名度，它在顯微數(shù)碼互動(dòng)方面也有較強(qiáng)的實(shí)力；永新光學(xué)是第二品牌，包括寧波永新與江南永新；其他品牌還有重慶光電、江西鳳凰光學(xué)、桂林光學(xué)廠和浙江舜宇等。

2 顯微鏡實(shí)驗(yàn)教學(xué)模式技術(shù)的發(fā)展

2.1 傳統(tǒng)顯微鏡實(shí)驗(yàn)教學(xué)模式的弊端

傳統(tǒng)顯微鏡教學(xué)實(shí)驗(yàn)的方法：每個(gè)學(xué)生一臺(tái)顯微鏡，教師也有一臺(tái)顯微鏡；教師以自己的顯微鏡為教具，演示講解顯微鏡如何使用，學(xué)生對(duì)照老師講解操作自己的顯微鏡。部分學(xué)生在使用顯微鏡時(shí)總是找不到目標(biāo)物像，易把瓊脂等異物當(dāng)作目標(biāo)，這就需要教師不時(shí)走下講臺(tái)逐一調(diào)焦找目標(biāo)。對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果如何，教師不能逐一去驗(yàn)證。此教學(xué)模式導(dǎo)致上課秩序較亂，授課教師也疲于奔波，教學(xué)效果差。

2.2 數(shù)碼顯微互動(dòng)系統(tǒng)的顯微鏡教學(xué)模式

近年來(lái)，數(shù)碼顯微互動(dòng)系統(tǒng)的出現(xiàn)，是對(duì)傳統(tǒng)顯微鏡教學(xué)方式具有革命意義的變革，它是伴隨著計(jì)算機(jī)、通信和多媒體等技術(shù)的發(fā)展出現(xiàn)的。此系統(tǒng)由學(xué)生用數(shù)碼顯微鏡、教師用多功能數(shù)碼顯微鏡、軟件平臺(tái)、雙向語(yǔ)音交流系統(tǒng)、圖像處理分析系統(tǒng)、多媒體設(shè)備等組成[12]。學(xué)生顯微鏡內(nèi)的數(shù)碼信息傳輸?shù)浇處熾娔X上，教師可觀察到每位學(xué)生正在觀察的視野，繼而通過(guò)投影儀把所有圖像都投射到大屏幕上，可使每位學(xué)生在大屏幕上看到自己和其他學(xué)生所觀察的圖像。教師只需坐在講臺(tái)上，通過(guò)耳機(jī)和電子呼叫系統(tǒng)給學(xué)生做“一對(duì)一通話模式”或“一對(duì)多通話模式”講授，實(shí)現(xiàn)良好的師生互動(dòng)交流[13]，學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣被激發(fā)，教與學(xué)的效率也都明顯提高。

國(guó)內(nèi)知名顯微鏡廠商麥克奧迪、舜宇及山東易創(chuàng)等，都各自推出自己的顯微互動(dòng)系統(tǒng)，被許多院校用于形態(tài)學(xué)等實(shí)驗(yàn)教學(xué)[13-14]和普通微生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)[15]。

2.3 虛擬仿真顯微鏡技術(shù)的教學(xué)模式

如果說(shuō)數(shù)碼顯微互動(dòng)系統(tǒng)還需要真實(shí)顯微鏡的話，那另外一種剛開(kāi)始應(yīng)用的、完全不需要顯微鏡的顯微鏡教學(xué)技術(shù)手段——顯微鏡虛擬仿真教學(xué)，則是對(duì)于顯微鏡實(shí)驗(yàn)教學(xué)模式的又一次革命，它是伴隨計(jì)算機(jī)虛擬技術(shù)發(fā)展來(lái)的[16]。使用虛擬顯微鏡系統(tǒng)，不必購(gòu)置昂貴的顯微鏡設(shè)備和易損耗的玻片，能讓學(xué)生無(wú)任何危險(xiǎn)地了解顯微鏡構(gòu)造，又可以讓學(xué)生不斷地進(jìn)行無(wú)損練習(xí)與反復(fù)操作顯微鏡，這有利于對(duì)顯微鏡實(shí)驗(yàn)過(guò)程的盡快認(rèn)知與上手[16]。顯微鏡虛擬仿真教學(xué)促使從以教師為中心的授課形式變?yōu)橐詫W(xué)生為中心的個(gè)性化教學(xué)，學(xué)生由被動(dòng)聽(tīng)講變?yōu)橹鲃?dòng)學(xué)習(xí)，實(shí)現(xiàn)了在沒(méi)有教師參與情況下自己學(xué)習(xí)，極大地提高了學(xué)生的學(xué)習(xí)主動(dòng)性。

目前從事顯微鏡虛擬仿真研發(fā)的公司還很少，它只在一定程度上替代顯微鏡操作而不能完全代替顯微鏡，畢竟實(shí)際動(dòng)手操作的效果要強(qiáng)于任何媒體教學(xué)。不過(guò)作為一種新型的教學(xué)媒體，隨著開(kāi)發(fā)成本的降低，這種新的技術(shù)必將廣泛應(yīng)用于教學(xué)之中，發(fā)揮其特有的先前指導(dǎo)作用。

3 結(jié)語(yǔ)

光學(xué)顯微鏡一直在不斷發(fā)展之中，它的每一進(jìn)步都將直接推動(dòng)微生物等微觀研究領(lǐng)域?qū)W科的發(fā)展。隨著計(jì)算機(jī)等行業(yè)的快速發(fā)展，以顯微鏡為工具的實(shí)驗(yàn)教學(xué)技術(shù)必將不斷革新，實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果也將得以不斷優(yōu)化、增強(qiáng)。

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Review of Experiment of Environmental Microbiology

Ye Jinsong

Optical microscopy is the essential and basic tool for microscopic observation in environmental microbiology experiments. The development history of the optical microscope, with focus on the latest progress of technology breakthrough of the optical resolution of optical microscopes was introduced. For illustration of the development of the teaching mode of experiments based on microscopes, the digital microscope mutual system and the latest microscope virtual simulation system that can partly replace real microscope functions were introduced and their applications were expected.

environmental microbiology; experiment; optical microscope

G642.423

B

1671-489X(2013)18-0128-03