任忠國
·實驗研究·
聚凝胺-微孔板法不規(guī)則抗體篩選方法的建立
任忠國
目的建立聚凝胺-微孔板法篩查獻(xiàn)血者不規(guī)則抗體的自動化檢測方法。方法通過對紅細(xì)胞濃度、聚凝胺試劑中各試劑量的加入比例、CUTOFF值的選擇等,確定篩查方法的最佳參數(shù)與過程。結(jié)果確定的試驗方法經(jīng)實際工作檢測,準(zhǔn)確率高、靈敏度好,并實現(xiàn)了操作的自動化、標(biāo)準(zhǔn)化與批量化。結(jié)論聚凝胺-微孔板法適用于血站系統(tǒng)對獻(xiàn)血者不規(guī)則抗體的大批量篩查。
聚凝胺-微孔板法;不規(guī)則抗體;批量化檢測;結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)化
對獻(xiàn)血者進(jìn)行不規(guī)則抗體的篩查,可以避免獻(xiàn)血者血液中的不規(guī)則抗體輸入患者體內(nèi)引起的溶血性輸血反應(yīng)。目前在國內(nèi)大多數(shù)血站并未采用全自動血型儀篩查獻(xiàn)血者的不規(guī)則抗體,采用的方法多為鹽水法、酶法、抗人球蛋白法及聚凝胺等試管法進(jìn)行操作,難以進(jìn)行大批量標(biāo)本的檢測。2011年起,我站采用聚凝胺-微孔板法進(jìn)行獻(xiàn)血者不規(guī)則抗體的篩查,實現(xiàn)了檢測標(biāo)本的批量化、標(biāo)準(zhǔn)化和自動化?,F(xiàn)報告如下。
1.1材料
1.1.1血標(biāo)本 全部為本站獻(xiàn)血者的血液標(biāo)本。
1.1.2儀器 AT PLUS2 全自動樣本處理系統(tǒng):瑞士HAMILTON公司;
HTIII掃描酶標(biāo)儀:奧地利ANTHOS公司;
Thermostar 溫育振蕩器:奧地利ANTHOS公司;
UNIVERSAL 32 平板離心機(jī):德國;
96孔硬質(zhì)U型微孔板:浙江拱東。
1.1.3試劑 聚凝胺試劑:珠海貝索生物技術(shù)有限公司;O型篩選譜細(xì)胞、抗人球蛋白試劑、抗-D血清:上海血液生物醫(yī)藥責(zé)任公司。
1.1.4LISWELL實驗室管理軟件:煙臺海深威公司。
1.2方法 96孔微孔板每孔加注獻(xiàn)血者血清50ul→加入篩選譜細(xì)胞30ul→加入LISS液150ul →加入聚凝胺試劑30ul→設(shè)置AT加樣儀暫停→離心(200 g)1 min→棄上清(直接棄或采用AT儀吸取)→放入振蕩混旋15 s→觀察全部凝集:試驗有效→AT儀中繼續(xù)加懸浮液50 ul→放入振蕩混旋30 s→酶標(biāo)儀(620nm)掃描判讀結(jié)果。
2.1實驗條件的選擇 ①O型篩選細(xì)胞:將購入的三支O型篩選譜細(xì)胞等體積混合,做為不規(guī)則抗體的篩選細(xì)胞。②陽性對照:IgG抗D血清(10倍稀釋)。③溫育振蕩條件的選擇:根據(jù)不規(guī)則抗體血清反應(yīng)的最適溫度,設(shè)定反應(yīng)溫度為37℃,選擇加入懸浮液后的振蕩時間、振幅、振蕩頻率為30 s、振幅為1、頻率為800RPM。④離心條件的選擇:根據(jù)聚凝胺試劑說明書確定離心條件為200 g,1 min。⑤掃描點數(shù)及Cutoff值的確定:根據(jù)微孔凝集反應(yīng)的特點:凝集紅細(xì)胞沉集于孔底,形成鈕扣狀;未凝集紅細(xì)胞混旋后,均勻散布于孔底。所以凝集孔由孔中心向外透光率逐漸增大;而未凝集孔,整孔透光率較一致,無大的變化。根據(jù)這一特點,我們確定掃描點為除孔中心19點外的16點為掃描點(酶標(biāo)儀為35點掃描)。
Cutoff值的確定:采用馮健亮[1]等研究的微板法Cutoff值符合正態(tài)分布的結(jié)論,利用數(shù)理統(tǒng)計方法計算得出的自動微板法Cutoff值,確定本法Cutoff值為0.36~0.50。<0.36為陰性,>0.50為陽性,介于兩者之間的為可疑標(biāo)本,采用試管法以抗人球蛋白的方法確認(rèn)。
2.2應(yīng)用效果 自2011年3月份以來,我們共進(jìn)行了近2萬人份的不規(guī)則抗體篩查工作。篩查出6例不規(guī)則抗體陽性標(biāo)本,經(jīng)進(jìn)一步確認(rèn),全部為陽性,一次判讀陽性準(zhǔn)確率達(dá)100%。
不規(guī)則抗體的篩查方法有多種,如鹽水法、酶法、抗人球法、聚凝胺法以及微柱凝膠等方法[2],這些方法各有優(yōu)缺點,如鹽水法僅能檢測IgM類抗體,其他幾種方法雖能檢測出各類不規(guī)則抗體,但由于采用試管法,操作時間較長,難以批量化、自動化檢測,因此多用于抗體的鑒定。采用微孔板法進(jìn)行不規(guī)則抗體篩查,也有過報導(dǎo)。如采用抗人球-微孔板法進(jìn)行的篩查方法[3],存在著檢測時間長,中間過程紅細(xì)胞需洗滌等。還有報導(dǎo)采用聚凝胺-微孔板法檢測不規(guī)則抗體,但中間過程不棄上清,直接在加入聚凝胺的LISS液中加入懸浮液,然后通過混旋振蕩來觀察結(jié)果。這種方法會因為減少一步操作而節(jié)約了檢測時間,但不可避免的會由于LISS液、聚凝胺與懸浮液之間產(chǎn)生的中和反應(yīng),而使檢測結(jié)果的靈敏度及特異性均會有不同程度的下降。而采用本檢測方法則可有效避免這一過程,既可使檢測時間縮短,操作過程簡便,又可保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
我們利用全自動酶標(biāo)加樣系統(tǒng)建立的全自動不規(guī)則抗體篩查方法在進(jìn)行了大量數(shù)據(jù)優(yōu)化的基礎(chǔ)上,經(jīng)近2萬份樣本的實際檢測,一次判讀的陽性準(zhǔn)確性達(dá)100%。具有操作簡便,使用試劑量較少,結(jié)果判讀準(zhǔn)確率較高,易于推廣與批量化等優(yōu)點。同時在檢測方法學(xué)上,有研究表明聚凝胺-微孔板法對弱陽性IgG抗D抗體檢測的靈敏度高于試管法[4],因此適合血站系統(tǒng)對大批量樣本的不規(guī)則抗體的快速篩查。
[1] 馮健亮,等. ABO血型自動微板法Cutoff值建立研究.現(xiàn)代檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2003,18(4):31-32.
[2] 高峰.輸血與輸血技術(shù).人民衛(wèi)生出版社,2003:90-95.
[3] 韓惠云,張國平,李雪英,等.自動微板法篩查獻(xiàn)血者不規(guī)則抗體的參數(shù)優(yōu)選.中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用,2011,4(5):149-150.
[4] 李鑫,葛紅衛(wèi),涂東晉,等.聚凝氨-微板法篩查不規(guī)則抗體的實驗研究.福建醫(yī)藥雜志,2007,29(5):107-109.
117000 遼寧省本溪市中心血站