陳 冬 賀 欣 宮 亮 李 里 (遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科，遼寧 錦州 000)

胰島素樣生長(zhǎng)因子－1受體在小鼠毛細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)

陳 冬 賀 欣1宮 亮 李 里2(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科，遼寧 錦州 121000)

目的觀察在小鼠耳蝸毛細(xì)胞中胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)-1受體(IGF1R)分布和表達(dá)情況，探討其生物學(xué)特點(diǎn)。方法制作耳蝸組織鋪片，采用熒光免疫組織化學(xué)染色方法，激光共聚焦顯微鏡觀察小鼠發(fā)育期間(出生后P0-P20)的IGF-1R在耳蝸毛細(xì)胞的分布和定位。應(yīng)用Western印跡及實(shí)時(shí)PCR法檢測(cè)新生小鼠毛細(xì)胞在出生后不同時(shí)期IGF-1R蛋白及mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果耳蝸組織鋪片熒光免疫組織化學(xué)染色方法顯示:IGF-1R在小鼠耳蝸發(fā)育過(guò)程中在毛細(xì)胞均有表達(dá)，部位在細(xì)胞膜上。隨著年齡的增加表達(dá)減少。Western印跡及實(shí)時(shí)PCR顯示小鼠耳蝸毛細(xì)胞的細(xì)胞膜蛋白及mRNA表達(dá)水平隨著出生年齡增加而逐漸減少。P0組和P4組，P12組，P20組細(xì)胞膜蛋白及mRNA的表達(dá)水平相比具有明顯差異(P＜0.05)，而P12和P20兩組間比較無(wú)明顯差異(P＞0.05)。結(jié)論在小鼠耳蝸發(fā)育成熟過(guò)程中在耳蝸毛細(xì)胞IGF-1R均有表達(dá)，表達(dá)量隨著出生年齡增加而減少。推測(cè)在內(nèi)耳細(xì)胞發(fā)育增殖過(guò)程中起重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。

胰島素樣生長(zhǎng)因子受體;毛細(xì)胞;耳蝸

胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF1)及其受體(IGF1R)促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制凋亡，在組織器官及疾病發(fā)生發(fā)展中的作用是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。IGF1的生物學(xué)功能由其表面的特異性靶細(xì)胞受體IGF1R介導(dǎo)，在耳蝸的成熟發(fā)育過(guò)程中及協(xié)調(diào)組織器官內(nèi)穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用。IGF1R在包括內(nèi)耳毛細(xì)胞及支持細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育中受多種生長(zhǎng)因子調(diào)控。IGF-1R對(duì)動(dòng)物聽(tīng)覺(jué)感覺(jué)上皮和神經(jīng)元的發(fā)育、分化及存活可能有一定的調(diào)節(jié)作用。IGF-1R在耳蝸的生長(zhǎng)發(fā)育中的研究至今仍無(wú)報(bào)道。近年來(lái)IGF-1R在防護(hù)腫瘤及神經(jīng)損傷方面應(yīng)用廣泛〔1，2〕，但其在耳蝸發(fā)育中的變化仍無(wú)相關(guān)報(bào)道。本研究將檢測(cè)生長(zhǎng)發(fā)育中的小鼠耳蝸IGF-1R的表達(dá)和定位分布特點(diǎn)，并探討其生物學(xué)特性及意義。

1 材料與方法

1.1 材料 TRIZOL(Invitrogene，CA，USA)，Cy5-AffiniPure山羊抗鼠 IgG，F(xiàn)cγ Subclass 1 Specific(Jackson，USA)，小鼠抗IGF-1R單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)，實(shí)時(shí)PCR試劑盒(美國(guó)Qiagen公司)，圖像采集應(yīng)用美國(guó)BioRad公司的Molecular Imager VersaDoc MP Systems。

1.2 免疫組織化學(xué)染色法觀察IGF-1R在耳蝸的表達(dá) 隨機(jī)選取在出生后4 d(P4)，8 d(P8)的新生小鼠，每組8只(16耳)，制作的耳蝸組織鋪片，滴加一抗IGF-1R(1∶500)，以及適當(dāng)比例稀釋的羅丹明鬼筆環(huán)肽和神經(jīng)絲蛋白抗體(1∶100)，4℃過(guò)夜。PBS沖洗，5 min×3次。滴加熒光分子標(biāo)記的混合二抗，兩者以1∶1的比例混合。然后在室溫下中孵育40 min，封片。激光共聚焦顯微鏡下觀察IGF-1R在耳蝸毛細(xì)胞的分布和定位。

1.3 Western印跡法檢測(cè)IGF-1R蛋白表達(dá) 隨機(jī)選取4組在出生后不同時(shí)期0天(P0)，P4，12 d(P12)，20 d(P20)的新生小鼠，每組16只(32耳)，取小鼠耳蝸基底膜蛋白。Western印跡技術(shù)檢測(cè)耳蝸基底膜IGF-1R蛋白:將總蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后(每一樣本均含60μg總蛋白)，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測(cè)IGF-1R的表達(dá)。所用抗體為羊抗IGF-1R(Santa Cruz公司，稀釋度為1∶500)及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的馬抗羊抗體(北京中山生物制品有限公司，稀釋度為1∶1 000)。用IGF-1R的灰度值表示IGF-1R的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)IGF-1R mRNA表達(dá) 隨機(jī)選取4組在出生后不同時(shí)期 P0，P4，P12，P20的新生小鼠，每組16只(32耳)，提取小鼠耳蝸基底膜組織總RNA。將提取的1μg總RNA擴(kuò)增成DNA目的片段。反應(yīng)循環(huán):95℃預(yù)變性5 min，94℃變性50 s，50℃退火 55 s，72℃延伸 1 min，40 個(gè)循環(huán)。4℃保存。IGF-1R引物序列參照文獻(xiàn):上游引物:5'-GCT GAG CTG GTG GACGCT CT AG-3';下游引物:5'-AAT GTT TAC TTG TGT ATT TCA TTG-3';目的片段為208 bp;內(nèi)參β-actin上游引物:5'-CTCCTCTTGCTCGAAGTCTC-3';下游引物5'-TCGATGTCGAAGACCTTCAACA-3';目的片段為201 bp。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳、紫外分析儀觀察、照相，應(yīng)用圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，IGF-1R與β-actin的灰度比值表示IGF-1R的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件包，組間差異比較用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 熒光免疫組化觀察IGF-1R小鼠耳蝸HC的表達(dá) 一抗、二抗孵育后，激光共聚焦顯微鏡下觀察，IGF-1R抗體結(jié)合部位發(fā)出綠色熒光。小鼠耳蝸HC細(xì)胞有IGF-1R表達(dá)，主要分布于細(xì)胞膜。IGF-1R在P0、P4、P12和P20小鼠耳蝸鋪片毛細(xì)胞中的表達(dá)量隨著出生年齡增加而逐漸減少。見(jiàn)圖1。

2.2 IGF-1R蛋白及mRNA在小鼠耳蝸HC的表達(dá)檢測(cè) 隨著出生年齡增加，小鼠耳蝸毛細(xì)胞的IGF-1R蛋白和mRNA表達(dá)水平逐漸減少。P0組和P4組，P12組，P20組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，P4組和P12組，P20組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

圖1 IGF-1R在不同出生年齡小鼠耳蝸鋪片HC中的分布狀態(tài)

表1 IGF-1R蛋白和mRNA在各組小鼠的耳蝸基底膜組織中的表達(dá)(±s，n=32)

表1 IGF-1R蛋白和mRNA在各組小鼠的耳蝸基底膜組織中的表達(dá)(±s，n=32)

與P0組比較，2)與P4組比較:均P＜0.05

組別 IGF-1R/β-actin IGF-1RmRNA/β 1.93±0.51 1.97±0.61 P4組 1.43±0.441) 1.59±0.761)P12組 0.54±0.211)2) 0.64±0.411)2)P20組 0.39±0.091)2) 0.58±0.221)2)-actin P0組

3 討論

IGF-1R和胰島素有同源性。其是一種酪氨酸蛋白受體，可以與IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ結(jié)合。結(jié)合后將使細(xì)胞內(nèi)的酪氨酸激酶激活，從而激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路，促使細(xì)胞分裂分化以及組織器官的生長(zhǎng)發(fā)育成熟。IGF-IR能夠發(fā)揮有絲分裂原作用，可以調(diào)控細(xì)胞分裂分化和增殖。對(duì)腦的發(fā)育以及神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)起到重要作用〔3～6〕。

本研究結(jié)果表明IGF-1R在小鼠耳蝸的成長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。隨著耳蝸發(fā)育的逐漸成熟其表達(dá)下調(diào)，調(diào)控能力下降。IGF-1R與IGF-I結(jié)合后，激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。IGF-1R的表達(dá)與IGF-I密切相關(guān)。IGF-1可由體內(nèi)很多組織器官分泌，如肝臟分泌循環(huán)中IGF-1，生長(zhǎng)激素/IGF-1軸(HG/IGF-1 Raxis)調(diào)節(jié)其表達(dá)〔7，8〕。IGFBP是一組和IGF-1R具有高度親和力的蛋白質(zhì)，已發(fā)現(xiàn)10種IGFBP，已成功克隆IGF-1R-6。IGFBP調(diào)節(jié)IGF-1R水平從而影響其生物效應(yīng)。

IGF-1R與IGF-1結(jié)合后調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的全過(guò)程，維持調(diào)節(jié)神經(jīng)元的增生，分化及營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)功能。在神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)方面的研究表明:在IGF-1培養(yǎng)液中生長(zhǎng)的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量是正常培養(yǎng)的數(shù)十倍。在有神經(jīng)損傷的大鼠模型中研究表明:在損傷后第3天在受累腦組織區(qū)域IGF-1和IGF-1R mRNA的表達(dá)量明顯增加增加〔9，10〕。IGF-1R目前在腫瘤學(xué)及神經(jīng)損傷方面已進(jìn)行研究，IGF-1R有望成為治療神經(jīng)損傷疾病的新靶點(diǎn)。但目前IGF-1R在耳聾保護(hù)的作用機(jī)制尚未完全清楚。

1 Murillo-Cuesta S，Rodríguez-de la Rosa L，Cediel R，et al.The role of insulin-like growth factor-I in the physiopathology of hearing〔J〕.Front Mol Neurosci，2011;4:11-6.

2 Michel Goedert.Tau protein and the neurofibrillary pathology of deafness〔J〕.TINS，1993;16(11):460-5.

3 Dupraz S，Grassi D，Karnas D，et al.The insulin-like growth factor 1 receptor is essential for axonal regeneration in adult central nervous system neurons〔J〕.PLoSOne，2013;8(1):e54462-71.

4 Fahrenholtz CD，Beltran PJ，Burnstein KL.Targeting IGF-IR with ganitumab inhibits tumorigenesis and increases durability of response to androgen-deprivation therapy in VCaP prostate cancer xenografts〔J〕.Mol Cancer Ther，2013:24(1):234-8.

5 Singh I，Amin H，Rah B.Targeting EGFR and IGF 1R:a promising combination therapy for metastatic cancer〔J〕.Front Biosci，2013;5(2):231-46.

6 Fujita M，Takada YK，Takada Y.Insulin-like growth factor(IGF)signaling requires αvβ3-IGF1-IGF type-1 receptor(IGF1R)ternary complex formation in anchorage-independence and the complex formation does not require IGF1R and Src activation〔J〕.J Biol Chem，2012:14(2):456-61.

7 Gerdes HH，Kaether C.Green fluorescent protein:applications in cell biology〔J〕.FEBS Lett，1996;389:44-7.

8 Magarios M，Aburto MR，Sánchez-Calderón H，et al.RAF kinase activity regulates neuroepithelial cellproliferation and neuronal progenitor cell differentiation during early inner ear development〔J〕.PLoS One，2010;5(12):e14435-41.

9 Baulac S，LaVoie MJ，Kimberly WT，et al.Functional gamma-secretase complex assembly in Golgi/trans-Golgi network:interactions among IGF〔J〕.Neurobiol Dis，2003;14:194-204.

10 Price DL，Wong PC，Markowska AL，et al.The value of transgenic models for the study of neurodegenerative diseases〔J〕.Ann N Y Acad Sci，2000;920:179-91.

The expression of IGF-1R in hair cells of normal developingm ice

CHEN Dong，HE Xin，GONG Liang，et al.
Ear Nose Throat Department，the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical College，Jinzhou 121000，Liaoning，China

ObjectiveTo study the expression and distribution of IGF-1R of the inner ear in normal developingmice，and to elucidate the function and biological characteristics of IGF-1R.MethodsThe expression and distribution of IGF-1R of the inner ear during normal developing(P0-P20 after birth)micewas observed by fluorescence immunohistochemistry with laser scanning confocalmicroscope.IGF-1R protein andmRNA was examined byWestern blotand realtime PCR.ResultsIn the hair cell of cochlea，themRNA expressions of IGF-1R detected by in situ hybridization were almost the same as the protein expressions of IGF-1R tested with immunohistochemicalmethods.The IGF-1R was widely distributed in the cellmembrane of hair cells.The protein and mRNA expression of IGF-1R in hair cells and the quantity of expression decreased with aging.ThemRNA expression of IGF-1R in group P0 was higher than that in group P4，P12 and P20(P＜0.01)，and there was no significant difference between group P12 and group P20(P＞0.05).ConclusionsThere are expressions of IGF-1R in hair cells in normal developingmice.The expressions are related to ages and decrease with aging.IGF-1Rmay play an important role in signal transduction during inner ear cell proliferation in a paracrine and autocrinemanner.

Insulin-like growth factor receptor;Hair cells;Cochlea

R76

A

1005-9202(2013)12-2808-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2013.12.034

遼寧省教育廳高等學(xué)?？蒲许?xiàng)目(No.2009A460)

1 遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科 2 遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院兒科

陳 冬(1972-)，男，博士，副教授，副主任醫(yī)師，主要從事耳鼻咽喉科相關(guān)疾病研究。

〔2012-11-19收稿 2013-02-27修回〕

(編輯 張海彬)