王茉莉 潘 煜 姜 晶 遲秀梅 李婉玉 姜 濤 張 洪 牛俊奇

(長春一汽總醫(yī)院 吉林大學第四醫(yī)院感染科，吉林 長春 130011)

ITPA基因變異與干擾素聯(lián)合利巴韋林治療過程中發(fā)生貧血的相關性

王茉莉 潘 煜1姜 晶1遲秀梅1李婉玉1姜 濤2張 洪1?？∑?

(長春一汽總醫(yī)院 吉林大學第四醫(yī)院感染科，吉林 長春 130011)

目的探討C20orf194基因rs6051702位點和ITPA基因rs1127354位點與慢性丙型肝炎治療過程中利巴韋林引起的溶血性貧血之間的相關性。方法入選慢性丙型肝炎患者742例、健康人群203例，提取上述兩組人群的基因組DNA進行兩個位點的焦磷酸測序;對208名慢性丙型肝炎患者進行干擾素聯(lián)合利巴韋林抗病毒治療，并在抗病毒治療的基線、2 w、4 w、12 w對患者進行血常規(guī)、HCV RNA定量檢測。用SAS9.0軟件進行分析。結果(1)我國健康人群rs6051702及rs1127354位點的最小等位基因頻率分別為15.3%、15.8%，與歐洲和日本接近，但水平略低。(2)2、4、12 w血紅蛋白下降量與rs1127354位點的不同基因型的關系有統(tǒng)計學意義(均P＜0.05)，A等位基因具有保護作用。(3)2、4、12 w血紅蛋白下降量與rs6051702位點的不同基因型的關系無顯著差異(均P＞0.05)。(4)rs1127354位點4 w血紅蛋白降低超過3 g/dl的CC組與AC+AA組存在差別(P=0.001)。結論(1)rs6051702位點、rs1127354位點在慢性HCV感染者、健康人群之間沒有顯著差異。(2)rs6051702位點與抗HCV治療過程中血紅蛋白下降量無相關性。(3)ITPA基因rs1127354位點與抗HCV治療過程中血紅蛋白下降量呈明顯相關，含A等位基因(AC和AA型)的患者貧血程度較CC型的低，提示A等位基因為保護基因，可用來預測患者抗HCV治療過程中血紅蛋白下降的程度，并指導早期調(diào)整利巴韋林劑量。

慢性丙型肝炎;利巴韋林;溶血性貧血;單核苷酸多態(tài)性;ITPA基因

近期有研究表明，在歐裔美國人、美國黑人和白人慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染者中第20號染色體上C20orf194基因的rs6051702位點和三磷酸肌苷焦磷酸酶(ITPA)基因中的rs1127354位點的變異直接與利巴韋林治療慢性丙型肝炎病人4 w時血紅蛋白(HGB)下降程度密切相關〔1，2〕。日本的兩個研究證實在日本人群中ITPA基因遺傳變異能夠保護性抑制利巴韋林引起的溶血性貧血，其中rs1127354位點被確認為利巴韋林治療誘發(fā)溶血性貧血的最有效的預測因子，A等位基因為保護性基因，同時發(fā)現(xiàn)C20orf194基因的rs6051702位點和利巴韋林治療后HGB水平降低有關〔3，4〕。目前國內(nèi)尚沒有關于ITPA基因與干擾素(INF)聯(lián)合利巴韋林治療中貧血發(fā)生關系的報道。本研究擬明確我國北方人群中C20orf194基因和ITPA基因的等位基因頻率及基因型分布，探討C20orf194基因和ITPA基因多態(tài)性位點與慢性丙型肝炎治療過程中利巴韋林引起的溶血性貧血之間的相關性，找到利巴韋林治療引起溶血性貧血的預測因子。

1 材料與方法

1.1 對象 慢性丙型肝炎患者742例，來自丙型肝炎流行地區(qū)。健康人群203人。對742名慢性丙型肝炎患者進一步檢查，有208例患者簽寫知情同意書后進行INF聯(lián)合利巴韋林抗病毒治療。治療方案為INF-α500萬U隔日一次皮下注射、利巴韋林900 mg每日口服，并在抗病毒治療的基線、2 w、4 w進行血常規(guī)、HCV RNA定量檢測。其中有50例因不能保持較好的依從性，實際服用劑量低于治療劑量的80%，從本實驗數(shù)據(jù)中篩除，余158例患者最后進入統(tǒng)計學分析。其中男106例(67.1%)，年齡49(45～56)歲，基線體重65(58 ～70)kg，體重指數(shù)22.6(21.1～24.8)kg/m2，HGB 15.5(13.6 ～16.0)g/dl，血小板(PLT)167(132～200)×109/L，白細胞(WBC)5.70(4.7～6.8)×109/L，中性粒細胞3.4(2.6～4.0)×109/L，紅細胞4.8(4.4～5.2)×1012/L，HCV RNA 6.3(5.4～6.7)log轉換。

慢性丙型肝炎的診斷標準及治療適應證均根據(jù)2004年中華醫(yī)學會肝病學分會制定的《丙肝防治指南》中的規(guī)定。

1.2 主要試劑和儀器 離心柱型血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生物有限公司);全自動凝膠成像分析儀(上海培清生物科技有限公司);Roche COBAS?AmpliPrep?/TaqMan?全自動熒光定量PCR儀(美國);ABI7300熒光定量PCR儀(ABI公司);HCV RNA檢測試劑盒(羅氏分子系統(tǒng)，美國);血球分析儀BCC-3000B(長春迪瑞實業(yè)有限公司)。

1.3 基因組DNA的提取 采用離心柱方法提取全血基因組DNA，按照說明書進行操作。采用全自動凝膠成像分析儀分析DNA含量，從NCBI(美國國立生物技術信息中心)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)數(shù)據(jù)庫中查到SNP rs6051702的序列:AACTCACCATATAACAGGGGTTATTC〔A/C〕TTATATCCTCAAAGAGTGCACTGCC;SNP rs1127354的序列:TCGTTCAGATTCTAGGAGATAAGTTT〔A/C〕CATGCACTTTGGTGGCACAGAAAAT，利用焦磷酸測序的方法對該位點進行檢測。

1.4 血常規(guī)檢測 采集外周抗凝血2 m l，應用血球分析儀進行三分類檢測，檢查項目包括白細胞、紅細胞、HGB、血小板等。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SAS9.0統(tǒng)計軟件進行分析，使用χ2分析中的擬合優(yōu)度檢驗進行哈迪溫伯格遺傳平衡檢驗(HWE)，利用χ2檢驗、非參數(shù)秩和檢驗、配對T檢驗進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。計量資料如若不符合正態(tài)分布，則以中位數(shù)(四分位區(qū)間)表示。

2 結果

2.1 SNP rs6051702等位基因頻率和基因型頻率 SNP rs6051702位點檢測基因型為AA、AC及CC三種。遺傳平衡檢驗顯示，病例組與對照組均符合哈迪溫伯格遺傳平衡定律(P＞0.05)。慢性HCV感染人群和健康人群基因型比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=3.497，P=0.17)，等位基因頻率比較也無統(tǒng)計學差異(χ2=0.000 4，P=0.98)。見表 1。

表1 兩組SNP rs6051702基因型及基因頻率比較〔n(%)〕

2.2 SNP rs1127354等位基因頻率和基因型頻率 SNP rs1127354位點檢測基因型為CC、AC及AA三種。遺傳平衡檢驗顯示，病例組與對照組均符合哈迪溫伯格遺傳平衡定律(P＞0.05)。慢性HCV感染人群和健康人群基因型(χ2=0.861，P=0.65)及等位基因頻率(χ2=0.328，P=0.57)比較差異均無統(tǒng)計學意義。見表2。

表2 兩組SNP rs1127354基因型及基因頻率比較〔n(%)〕

2.3 158例慢性丙型肝炎病人治療后HGB下降程度 對158名患者進行2、4、12 w的回訪(分別有10、6、15人未參與相應的回訪工作，其對應的檢查結果缺失)，2、4、12 w HGB平均下降1.3(0.2～2.5)、1.7(0.8～3.0)、1.1(0 ～2.3)g/dl，嚴重貧血發(fā)生率分別為 13/148(8.8%)、8/152(5.3%)、4/143(2.8%)。

2.4 C20orf194基因rs6051702位點不同基因型與HGB下降的關系 158例患者 AA、AC、CC基因型分別為 113例(71.5%)、43例(27.2%)、2例(1.3%)。2 w時AA組HGB下降1.30 g/dl，AC+CC組 HGB降低1.45 g/dl;4 w時 AA組HGB下降1.70 g/dl，AC+CC組降低1.45 g/dl;12 w時AA組HGB下降1.30 g/dl，AC+CC組降低0.85 g/dl。三個位點均P＞0.05，提示兩組無顯著差異，rs6051702位點不同基因型與HGB下降量沒有明顯的聯(lián)系。

2.5 ITPA基因rs1127354位點不同基因型與HGB下降的關系 158例患者CC、AC、AA基因型分別為133例(84.2%)、21例(13.3%)、4例(2.5%)。2 w時CC組HGB下降1.60 g/dl，AC+AA組HGB升高0.4 g/dl;4 w時CC組HGB下降2.00 g/dl，AC+AA組降低0.7 g/dl;12 w時 CC組 HGB下降1.30 g/dl，AC+AA組降低0.6 g/dl。三個位點均 P＜0.05，提示不同基因型組間的差異有統(tǒng)計學意義，含次要等位基因A的AC+AA組HGB下降量低，A等位基因具有保護性抑制貧血的作用。

2.6 4 w時兩個SNP位點不同基因分型HGB降低超過3 g/dl、嚴重貧血(HGB＜10 g/dl)的分析結果 C20orf194基因rs6051702位點HGB降低超過3 g/dl的AA組25例(22.7%)，AC+CC組14例(33.3%)，二者沒有差別(P=0.18);HGB水平低于 10 g/dl的 AA組 4例(3.6%)、AC+CC組 4例(9.5%)，二者沒有差別(P=0.14)。ITPA基因rs1127354位點HGB降低超過3 g/dl的CC組39例(30.5%)，AC+AA組0例，二者存在差別(P=0.002);HGB水平低于10 g/dl的AA組7例(5.5%)，AC+CC組1例(4.2%)，二者沒有差別(P=0.79)。

3 討論

歐美人rs6051702位點的最小等位基因頻率(MAF)19.4%、日本人MAF 19.9%，本研究與歐洲和日本接近，但水平略低。歐美人rs1127354位點的MAF為7.6%、日本人MAF為14.2%，本研究與日本近似，與歐美人差距相對大。

本研究結果顯示，C20orf194基因上的rs6051702位點與2、4、12 w HGB下降量無相關性，且不同基因型與HGB下降超過3 g/dl及嚴重貧血無相關性。而rs6051702位點在歐美人群中與4 w時HGB下降表現(xiàn)了顯著的相關性(P=1.1×10－45)〔1〕。日本Sakamoto等〔4〕的研究中，rs6051702位點與HGB下降量表現(xiàn)輕度的相關性〔odds ratio(OR)=1.40，P=9.0 ×10－3〕。這種差異可能是由于基因的連鎖不平衡(LD)在亞洲處于低水平所致。據(jù)報道，該C20orf194基因的rs6051702位點在不同種族之間與HGB降低的關系也存在差異，非洲裔人P=0.19，西班牙人 P=9.5 ×10－3〔1〕。

本研究通過非參數(shù)秩和檢驗，發(fā)現(xiàn)ITPA基因上的rs1127354位點與2、4、12 w HGB下降量存在明顯相關性，提示rs1127354位點的遺傳變異與HGB下降量相關，AA+AC組平均HGB下降量低于CC組，提示rs1127354位點可用來預測患者接受利巴韋林治療后引起的溶血性貧血。而含有A等位基因的患者貧血出現(xiàn)的概率小，A等位基因為保護性基因，這與文獻報道一致〔1～4〕。

4 w時rs1127354位點的CC基因型中有69.5%的病人沒有出現(xiàn)明顯貧血，考慮可能存在其他一些低頻率的ITPA基因的SNP或細胞中存在其他酶類對利巴韋林引起的溶血性貧血具有保護作用。其中中國北方慢性丙型肝炎rs1127354位點CC型病人抗病毒治療4 w時HGB降低超過3 g/dl的占30.5%，明顯低于歐美人的 48.4%〔1〕和日本人的48.7%〔4〕，原因考慮為:(1)樣本量相對小;(2)患者的依從性影響治療效果，且利巴韋林引起的溶血性貧血是劑量依賴的、可逆的，總體劑量的減少必然引起貧血出現(xiàn)概率降低;(3)不同種族及人群影響利巴韋林引起溶血性貧血的發(fā)生率。

本研究中的患者跟蹤到12 w，尚未涉及到24 w、48 w后治療結果的部分，沒有對SNP位點的遺傳變異與治療結果的關系進行研究。在INF聯(lián)合利巴韋林抗病毒治療的過程中，病人保持良好的依從性是非常重要的，這樣可保持較好的治療應答。在美國〔5〕和日本〔6〕的研究中證實增加利巴韋林用量可提高患者的持續(xù)病毒應答(SVR)。Thompson等〔2〕的研究表明 ITPA遺傳變異與SVR存在明顯的相關性，而Sakamoto等〔4〕的研究中發(fā)現(xiàn)ITPA遺傳變異與抗病毒治療的效果的相關性不明顯，分析原因考慮與患者的年齡及肝臟纖維化程度的影響有關。這些有待在中國人群中進一步檢驗和認證。

1 Fellay J，Thompson AJ，Ge D，et al.ITPA gene variants protect against anaemia in patients treated for chronic hepatitis C〔J〕.Nature，2010;464(7287):405-8.

2 Thompson AJ，F(xiàn)ellay J，Patel K，et al.Variants in the ITPA gene protect against ribavirin-induced hemolytic anemia and decrease the need for ribavirin dose reduction〔J〕.Gastroenterology，2010;139(4):1181-9.

3 Ochi H，Maekawa T，Abe H，et al.ITPA polymorphism affects ribavirininduced anemia and outcomes of therapy-A genome-wide study of Japanese HCV virus patients〔J〕.Gastroenterology，2010;139(4):1190-7.

4 Sakamoto N，Tanaka Y，Nakagawa M，et al.ITPA gene variant protects against anemia induced by pegylated interferon-a and ribavirin therapy for Japanese patientswith chronic hepatitis〔J〕.Hepatol Res，2010;40(11):1063-71.

5 McHutchison JG，Lawitz EJ，Shiffman ML，etal.Peginterferon alpha-2b or alfa-2a with ribavirin for treatment of hepatitis C infection〔J〕.N Engl J Med，2009;361(6):580-93.

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R512.63

A

1005-9202(2013)12-2759-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2013.12.011

1 吉林大學第一醫(yī)院肝膽胰內(nèi)科 2 吉林省肝膽病醫(yī)院

?？∑?1958-)，男，教授，博士，博士生導師，主要從事病毒性肝炎研究。

王茉莉(1980-)，女，碩士，醫(yī)師，主要從事病毒性肝炎的分子生物學研究。

〔2012-10-11收稿 2013-01-02修回〕

(編輯 袁左鳴)