劉榮，于海峰

（1.榮成檢驗檢疫局，山東榮成264300；2.齊魯工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，山東濟南250353）

三苯甲咪唑氨基酸（mycosporine-like amino acids，MAAs）是一類水溶性、小分子（＜400 Da）、具有紫外吸收特性的化合物[1]。它是以環(huán)乙烯酮為基本骨架，與氨態(tài)氮或亞氨基醇共軛組成的，由于側(cè)鏈和取代基的不同，不同結(jié)構(gòu)的三苯甲咪唑氨基酸的波長吸收范圍也有所不同[2]。三苯甲咪唑氨基酸在微生物界的分布是非常廣泛的，在細菌、真菌、藍藻、浮游植物和大型藻類中都發(fā)現(xiàn)三苯甲咪唑氨基酸的存在[3]。目前前對于三苯甲咪唑氨基酸的研究主要集中于環(huán)境因素（紫外輻射強度、溫度、鹽度等）對藻類積累MAAs 的影響、紫外線對MAAs 的誘導(dǎo)及MAAs 的分布等方面。對這類紫外線吸收物質(zhì)的應(yīng)用研究只是剛剛起步，其研究范圍和深度都不夠。國內(nèi)對該領(lǐng)域的研究報道很少，本論文以液體懸浮培養(yǎng)的發(fā)菜細胞為原料，確定了其含有MAAs，研究了MAAs 化合物的紫外吸收及抗氧化的性質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 實驗原料

發(fā)菜細胞（Nostoc flagelliforme），由齊魯工業(yè)大學(xué)藻類生物技術(shù)研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 MAAs 粗提物的制備

將發(fā)菜與甲醇按1 ∶4（g ∶mL）的比例進行提取，初始pH 為2、溫度45 ℃、提取時間2 h。收集上清液，冰箱中放置24 h。過濾，旋蒸（45 ℃、50 r/min），將濃縮物按水∶氯仿的比例為2.5 ∶7.5（體積比）加入氯仿，取上層水溶液離心，冷凍干燥后即得MAAs 粗品[4]。

1.2.2 清除羥基自由基能力的測定

該實驗采用H2O2/Fe2+體系。將1 mL 9 mmol FeSO4、1 mL 9 mmol 水楊酸-乙醇與不同濃度的MAAs 溶液混勻，37 ℃水浴30 min，5 000 r/min 離心5 min，加入1 mL 9.8 mmol H2O2啟動整個反應(yīng)。510 nm 下測定添加不同濃度MAAs 溶液的吸光值[5]。清除率的計算公式：

式中：A0為空白參比液的吸光值；AX為加入MAAs 溶液后反應(yīng)體系的吸光值；AX0為MAAs 溶液的本底吸收值。因待測反應(yīng)體系本身存在著吸光值，該試驗中以1 mL 9 mmol FeSO4、1 mL 9 mmol 水楊酸-乙醇、1 mL MAAs 溶液和1 mL 蒸餾水作為待測溶液的本底吸收值。

1.2.3 清除超氧離子能力的研究

取4.5 mL pH 8.2、濃度50 mmol Tris-HCl 緩沖液，15 μL 蒸餾水，搖勻，25 ℃水浴20 min，分別加入1 mL不同濃度的MAAs 粗品溶液，再加入15 μL 預(yù)熱過的（25 ℃）鄰苯三酚（3 mmol，用10 mmol HCl 配置）。混勻，測定325 nm 下MAAs 溶液的吸光度值[80]。每30 s測定一次數(shù)值，以每分鐘的樣品溶液吸光度增加值來計算MAAs 的清除率。清除率的計算公式：

式中：ΔA0為鄰苯三酚的自氧化速率；ΔA 為加入MAAs 溶液后鄰苯三酚的自氧化速率。

1.2.4 MAAs 紫外吸收能力的鑒定

稱取MAAs 粗提物0.05 g，將其與防曬系數(shù)為20的防曬乳霜按質(zhì)量比1 ∶1、1 ∶2 的比例混合均勻，分別溶入20 mL 水中，于280 nm～400 nm 波長范圍內(nèi)進行光譜掃描，以未添加MAAs 粗提物的防曬乳霜做空白對照[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 MAAs 對超氧陰離子清除能力的測定

MAAs 對超氧陰離子的清除效果見圖1。

圖1 MAAs 清除超氧離子能力的研究Fig.1 The superoxide anion scavenging activity of MAAs

在堿性環(huán)境下鄰苯三酚能夠迅速發(fā)生氧化，釋放出超氧陰離子，進而生成有色的中間產(chǎn)物。加入抗氧化物質(zhì)能夠使溶液體系顏色變淺，325 nm 處吸光度降低。試驗結(jié)果表明MAAs 具有清除超氧陰離子的作用。其清除作用隨MAAs 濃度的增大而增大，當(dāng)MAAs 濃度為7.05mg/mL 時，對超氧陰離子的清除率為59.01%。需氧生物體內(nèi)95%的氧分子可以作為電子受體在物質(zhì)代謝過程中發(fā)揮作用，最終被還原成水，而剩余的5%則在還原過程中由于接受的電子數(shù)目不等從而形成了多種性質(zhì)活潑的活性氧，氧分子受單一電子還原的產(chǎn)物稱為超氧陰離子。定量的超氧陰離子對于細胞來說是無害的，但過量即可造成組織損傷。紫外脅迫是一種重要的外源氧化應(yīng)激因素，超氧陰離子就是細胞受到紫外輻射后的一種產(chǎn)物，并進一步氧化成過氧化氫等其它自由基，對細胞造成傷害[7]。因此，細胞內(nèi)MAAs 含量的增加是發(fā)狀念珠藻響應(yīng)紫外脅迫的一個重要機制，它在短時間內(nèi)能夠有效地保護細胞避免受到過多的傷害。

2.2 MAAs 對羥基自由基清除能力的測定

MAAs 對羥自由基的清除效果見圖2。

圖2 MAAs 清除羥基自由基能力的測定Fig.2 The hydroxyl radical scavenging activity of MAAs

采用可見光分光光度法在510 nm 處測定MAAs對羥自由基的清除能力。反應(yīng)體系中，水楊酸能夠捕捉Fenton 反應(yīng)生成的羥自由基生成2，3-二羥基苯甲酸，然后通過分光光度法測定2，3-二羥基苯甲酸的量間接的測定羥自由基的生成量。

由圖2 可知，MAAs 具有清除羥自由基的能力，隨濃度的增大其清除效果越明顯。當(dāng)濃度為30.78 mg/mL時，清除率可達到78.64%。羥基自由基也是基體受到紫外脅迫后的一種產(chǎn)物，是活性氧中最活潑的自由基，也是活性最大的自由基，幾乎可以和細胞中的任何分子發(fā)生反應(yīng)，對蛋白質(zhì)、核酸、糖類和脂類都有損傷。MAAs 對羥自由基的清除作用進一步表明MAAs的生成能夠有效地保護細胞免受紫外的過多脅迫。

2.3 MAAs 抗紫外吸收能力的鑒定

MAAs 的紫外吸收效果見圖3。

圖3 MAAs 粗提物與防曬霜（SPF20）混合后紫外吸收能力的測定Fig.3 The absorption spectrum of mixture with different amount of MAAs with SPF20

從圖3 我們可以看出防曬乳霜及其與MAAs 粗提物混合物在200 nm～400 nm 波長范圍內(nèi)的吸光度。較純的防曬乳霜添加MAAs 粗提物后的樣品組吸光值在所測得波長范圍內(nèi)都有所增加。防曬乳霜吸收紫外的能力主要集中在280 nm～360 nm 處，而添加MAAs粗品后，防曬乳霜的紫外吸收能力在整個波長范圍內(nèi)都有顯著的提高。由此可以表明，MAAs 對防曬用品的防曬能力具有促進作用。

3 結(jié)論

MAAs 具有一定的抗氧化能力。MAAs 對超氧陰離子和羥自由基的清除作用隨濃度的增大而增大，MAAs含量的增加是發(fā)菜響應(yīng)紫外脅迫的一個重要機制，它在短時間內(nèi)能夠有效地保護細胞避免受到過多的傷害。防曬乳霜吸收紫外的能力主要集中在280nm～360nm處，而添加MAAs 粗品后，防曬乳霜的紫外吸收能力在整個波長范圍內(nèi)都有顯著的提高，說明MAAs 具有有效的防紫外線能力。在防曬要求日益提高的今天，MAAs 可作為一種較理想的防曬護膚物質(zhì)。

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