閆軍霞，畢孝瑞

（1．汕尾出入境檢驗檢疫局，廣東 汕尾516600；2．鲅魚圈出入境檢驗檢疫局，遼寧 營口115007）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是目前世界上對養(yǎng)豬業(yè)帶來重大經(jīng)濟損失的一種傳染性疾病，PRRSV是該病病原，一種具有包膜的單股正鏈RNA病毒，ORF1a，ORF1b編碼該病毒非結(jié)構(gòu)蛋白（Nsps）其編碼的ORF1a，ORF1ab兩個具有病毒的復制酶和RNA聚合酶功能的多聚蛋白pp1a和pp1b在蛋白水解酶裂解作用下產(chǎn)生至少12個推測的非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp1～Nsp12［1］。Nsp2作為PRRSV最大的非結(jié)構(gòu)蛋白，具有高變異特性及多種生物學特性且應用廣泛，在病毒研究中，Nsp2一直是研究熱點，本文就PRRSV的非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp2分子生物學特性、免疫學功能及其應用做一簡要綜述。

1 非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp2的生物學特性

在所有的非結(jié)構(gòu)蛋白中，Nsp2是PRRSV中最大的復制相關(guān)蛋白，目前已鑒定Nsp2四個主要功能區(qū)：N－端的半胱氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域（PL2）；功能尚未清楚的中間高變區(qū)；近C端的高親水性轉(zhuǎn)膜區(qū)；功能尚不明確的C端富含半胱氨酸殘基保守區(qū)。PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp2半胱氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域（Cp），介導 Nsp2／Nsp3切割，還是 Nsp4絲氨酸蛋白酶的輔助因子，C端與Nsp3之間的非共價結(jié)合作為多蛋白病毒復制復合體裝配的膜錨定器支持雙膜囊泡（DMV）的形成，Nsp2通過PL2區(qū)介導自身從前體蛋白上解離［2－3］，相關(guān)研究表明，Nsp2在感染過程中存在多種不同的亞型，包括nsp2a～nsp2f，nsp2a與nsp2產(chǎn)物的識別相關(guān)，一些小亞型（如nsp2d～nsp2f）對病毒的復制并無影響［4］。Nsp2是一個多功能蛋白，不同結(jié)構(gòu)域功能特性主要表現(xiàn)在對病毒的復制、致病性以及對宿主免疫調(diào)節(jié)方面作用。

1．1 對病毒復制及致病性方面 Nsp2半胱氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域?qū)儆诓溉閯游锬[瘤壞死因子相關(guān)蛋白超級家族成員，該蛋白酶活性對病毒的活力恢復起關(guān)鍵作用。在PRRSV感染的細胞中，Nsp2定位在核周區(qū)，該區(qū)域與上述雙膜囊泡（DMV）形成密切相關(guān)，是病毒的復制和轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵部位［2］。王鳳雪等發(fā)現(xiàn)，在 Marc－145細胞上感染PRRSV 病毒時Nsp2蛋白對PRRSV復制早期有正向調(diào)控作用［5］。2006年暴發(fā)的高熱病，鑒定病原為PRRSV變異株，在Nsp2上表現(xiàn)為30個氨基酸的不連續(xù)缺失，該病毒的毒力增強似乎與Nsp2 30個氨基酸缺失有關(guān)，但最終研究發(fā)現(xiàn)，該缺失與病毒高致病性沒有必然的聯(lián)系［3］。在體外傳代過程PRRSV Nsp2也常出現(xiàn)新的自然缺失，對病毒的復制影響，但對病毒致病性無直接聯(lián)系。然而，有研究表明，在體外傳代過程中病毒出現(xiàn)致弱，在Nsp2出現(xiàn)相關(guān)的突變可能與病毒毒力致弱有關(guān)，Leng等［6］對TJ株進行連續(xù)傳代過程中，出現(xiàn)58個氨基酸的突變，同時在非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp2區(qū)域在不連續(xù)的30個氨基酸缺失位481位和533－561位之后又出現(xiàn)連續(xù)120個氨基酸的缺失，傳至第20代時病毒致病性明顯減弱，推測TJ株在這一傳代過程中非結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白所發(fā)生的遺傳變異對病毒毒力致弱起到一定作用。

1．2 對宿主機體免疫調(diào)節(jié)作用 Nsp2蛋白被認為是PRRSV中最具有免疫原性的蛋白之一，可以誘導機體較強的抗體應答反應。Yan等鑒定出BJ－4株六處B細胞抗原表位，其中4個被確定為新型線性 Nsp2 表 位：T（73）－T（86），D（385）－D（394），P（452）－S（466）和P（467）－S（477）［7］。所有6個特異性抗體都能中和PRRSV表位，表現(xiàn)出免疫原性。變異株P(guān)RRSV Nsp2 30個氨基酸的缺失部位包含有之前已鑒定的B細胞表位和潛在的T細胞表位。Nsp2的高突變性以及自然缺失等都可能與病毒逃避宿主免疫監(jiān)測相關(guān)。有相關(guān)研究對Nsp2六處抗原表位（ES2－ES7）進行缺失，發(fā)現(xiàn)缺失ES3，ES4，ES7時能拯救出病毒，缺失ES4，ES7時病毒出現(xiàn)致弱，然而缺失ES3時卻相對親本株出現(xiàn)最高病毒滴度峰值，且IL－1β，TNF－α表達水平同時出現(xiàn)下調(diào)，表明Nsp2上的顯性表位不是病毒復制所必須，但是在宿主免疫反應中起重要作用［2］。Faaberg構(gòu)建了 PRRSV VR2332Nsp2 四 處 缺 失 （r727－r813，r543－r726，r324－r523，r324－r726），結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染缺失727－813位的毒株能明顯降低淋巴結(jié)腫大程度，感染其中3個缺失株機體產(chǎn)生γ干擾素水平顯著降低，表明該缺失部位可能改變了機體產(chǎn)生干擾素以及其他細胞因子的產(chǎn)生［8］。相關(guān)研究已證明，Nsp2通過影響多條通路來達到免疫調(diào)節(jié)效果：包括半胱氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域通過抑制IFN調(diào)節(jié)因子IRF－3的激活從而影響IFN的產(chǎn)生，另外通過干擾NF－kB信號通路中抑制因子IKBa的聚泛素化過程從而影響IKBa的磷酸化使得抑制因子不能降解最終導致I型干擾素的表達的抑制［9］。同時，Nsp2通過影響干擾素刺激基因15（ISG15）的產(chǎn)生和結(jié)合而達到抑制ISG15的抗病毒作用。然而Nsp2具有多重調(diào)節(jié)效果，Nsp2還具有激活NF－kB的作用，同時誘導NF－kappaB－依賴炎性因子的表達［10］。上述研究表明，Nsp2在調(diào)節(jié)宿主炎癥反應中具有多功能調(diào)節(jié)作用。具體相互之間的調(diào)節(jié)機理還有待進一步研究。

2 非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp2特性的應用

Nsp2具有高度的變異性以及在不同株之間表現(xiàn)為顯著的差異性，同時是歐洲型和美洲型關(guān)鍵分化變異位點。其中間高變區(qū)存在自然突變，插入，缺失現(xiàn)象而轉(zhuǎn)膜區(qū)和PL2區(qū)卻高度保守，這些特性使得Nsp2成為理想的檢測基因變異的標志性靶位點，常用于流行病學的監(jiān)測，廣泛應用于診斷檢測方法的建立及標記性重組疫苗的制備等［3］。

2．1 分子流行病學調(diào)查 毒株的 ORF5基因與Nsp2基因在自然環(huán)境及免疫壓力作用下發(fā)生了較大變異，因此常對Nsp2和GP5進行基因序列分析來了解PRRSV流行毒株的遺傳變異情況和分子流行病學情況。近幾年來國內(nèi)各地區(qū)分離株自2006年后主要以Nsp2 30個氨基酸不連續(xù)缺失株為主，且同源性均與高致病性毒株達90%以上。經(jīng)典毒株分離率明顯低于高致病性毒株，且相關(guān)報道表明，分離到非缺失株與國內(nèi)外分離的非缺失株相比，已經(jīng)存在一定程度的變異，在進化樹上顯示的親緣關(guān)系也漸行漸遠［11］。同時缺失株之間又存在一些新的變異特點，黃元等在廣東省地區(qū)分離到一個新型的PRRSV毒株BL2，其Nsp2基因540位～563位發(fā)生24個氨基酸序列的缺失，該缺失位于高致病性毒株的缺失區(qū)域內(nèi)，與我國2005年分離的經(jīng)典毒株SHB（91．5%）同源性最高，同時與2006年后流行的高致病性毒株也有較高的同源性（89．9%～91．3%）且為高致病性毒株［12］。Zhou等在中國分離到兩株新型變異株在Nsp2除原來的缺失外，又分別出現(xiàn)額外的36nt和57nt的缺失，且分別與JXA1同源性達到98．9% 和 97．1%［13］。Li B，等證明，高致病性毒株的新的基因變異特性并沒有顯著改變其致病性［14］。

2．2 診斷方法建立及疫苗研制 Nsp2本身具有多個抗原表位，有較高的免疫原性，同時常規(guī)PRRSV檢測中，我們常需要區(qū)分野毒和疫苗毒感染及經(jīng)典株和缺失株的感染，由于Nsp2的中間高變區(qū)具有耐受突變，插入，缺失能力，因此常作為靶位點進行基因改造廣泛應用于各種診斷方法研究。林華等［15］以高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（HPPRRSV）重組Nsp2蛋白為包被抗原，建立了檢測PRRSV抗體的間接ELISA方法，該方法敏感性高、特異性強，可用于豬繁殖與呼吸綜合征的常規(guī)診斷及流行病學調(diào)查。在區(qū)分疫苗毒和野毒感染方面，相關(guān)實驗室利用Nsp2可突變區(qū)插入GFP（綠色熒光蛋白）作為陽性標簽，并建立相應的ELISA檢測方法，利用該標記疫苗及相應抗原包被的ELISA試劑盒可以用于區(qū)別野毒感染和疫苗毒感染；對于缺失株和經(jīng)典株感染的區(qū)分，郭煥成等根據(jù)高致病性PRRSV Nsp2美洲型缺失及經(jīng)典毒株核苷酸差異，建立寡核苷酸芯片方法，能夠準確鑒別高致病性PRRSV Nsp2缺失變異株［16］。在疫苗研制方面，針對Nsp2常用于制備基因缺失苗以及基因標記工程苗，Kim等通過在Nsp2非關(guān)鍵區(qū)進行缺失并插入肽標記，發(fā)現(xiàn)拯救毒株毒力顯著降低，并能被特異抗原包被的ELISA試劑盒檢測，再次驗證了Nsp2是用來發(fā)展標記疫苗和弱毒苗的潛在靶基因［17］，Xu等在對疫苗毒HuN4－F112Nsp2復制非關(guān)鍵區(qū)缺失25個氨基酸，并插入新城疫N蛋白免疫顯性B細胞表位（49個氨基酸）作為一種基因標記疫苗，在動物體內(nèi)能同時產(chǎn)生對抗NDV NP及PRRSV的特異性抗體，而且缺乏針對缺失的25個氨基酸的抗體，免疫豬獲得很好的免疫保護，該疫苗可以作為一種有效的對抗PRRSV的基因標記苗［18］。

3 總結(jié)

PRRSV Nsp2多區(qū)域蛋白，其較高的免疫原性，高突變性，多調(diào)節(jié)功能以及耐受突變，缺失及插入的能力，使得對Nsp2的研究能在很大程度上對PRRSV流行病學情況、致病機理方面以及診斷方法和疫苗制備方面提供了很廣泛的視野，同時對PRRSV Nsp2相關(guān)生物學特性的了解有助于我們今后對Nsp2的進一步研究提供一定的基礎(chǔ)。

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