張軍艷 栗延偉 任玉琴 譚 軍

新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院神經內二科 新鄉(xiāng) 453003

本研究通過建立全腦缺血大鼠模型，觀察電迷宮訓練對全腦缺血大鼠空間辨別能力的影響，并觀測腦源性神經營養(yǎng)因子（brain－derived neurotrophic factor，BDNF）的變化，探討其可能的作用機制，進而為臨床上對患者進行學習記憶訓練改善血管性認知障礙（vascular cognitive impairment，VCI）患者的認知功能提供實驗室依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 健康成年雄性SD大鼠，清潔級，體質量（290±40）g，由河南省實驗動物中心提供。免疫組化試劑盒由北京中山生物技術有限公司提供。

1.2 實驗動物的篩選及分組 大鼠經Y型迷宮測試，將大鼠放入Y型迷宮箱中適應3～5min后，給予適當電擊，至其對3臂均探索進入為止，選擇活躍、對電擊反應較敏感、逃避反應迅速的大鼠進行訓練。淘汰掉反應過于遲鈍或特別敏感的大鼠。預選出達到連續(xù)2次正確反應，電擊次數(shù)≤3次，對電擊反應較敏感的大鼠供實驗用。在上述初步篩選的基礎上，通過正式迷宮訓練4～7d，淘汰達不到學會標準（學不會）的大鼠。將達到學會標準的90只大鼠隨機分成3組：假手術組、對照組和訓練組，每組30只。

1.3 全腦缺血模型制備 采用改良的Pulsineli 4血管閉塞法制作全腦缺血大鼠模型［1］。假手術組除不電凝椎動脈、不夾閉雙側頸總動脈外，其余過程與手術組相同。造模術后1周，對大鼠進行電迷宮測試，20次／d，連續(xù)3d，平均錯誤次數(shù)≥8次作為模型鼠認知障礙的判定標準。造模成功后，根據訓練時間的不同將各組再分為7d、14d和21d3組，分別編號、稱質量及分籠飼養(yǎng)，每個時間點10只。

1.4 學習記憶訓練 采用Y型電迷宮進行學習記憶能力訓練。采用固定次數(shù)隨機不休息法［2］，每輪固定訓練20次。每天訓練兩輪（08：00和20：00），連續(xù)訓練21d。分別在訓練的7d、14d、21d對大鼠進行檢測，連測3d取平均值記錄每只大鼠錯誤反應次數(shù)、全天總反應時間和潛伏期。

1.5 HE染色和免疫組織化學染色 各組大鼠分別于訓練的第7、14、21天進行學習記憶測試后斷頭取腦，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，片厚5μm。部分石蠟切片常規(guī)脫蠟及水化處理后，行蘇木素－伊紅（HE）染色，二甲苯常規(guī)脫水后中性樹脂封片，光鏡下觀察腦組織細胞形態(tài)學變化。另取部分石蠟切片經常規(guī)脫蠟至水化行免疫組織化學染色。陰性對照用PBS代替一抗。通過彩色圖文分析系統(tǒng)，在400倍物鏡下每組隨機選取5張切片。在每個海馬CA1區(qū)分別選擇5個相鄰的視野攝取圖像傳遞至計算機顯示屏，分析各組BNDF免疫陽性神經元的平均光密度值以反映BNDF表達的強弱。

1.6 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據處理，多組間比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠不同時間點學習記憶能力測試結果 術前各組大鼠的學習能力一致，均達到學會標準，錯誤反應次數(shù)為1.00±0.82，全天總反應時間（89.08±19.07）s，潛伏期（4.45±1.69）s。

訓練7d后，與假手術組比較，對照組學習記憶能力明顯減退，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與對照組比較，訓練組學習記憶能力改善明顯（P＜0.05）；與假手術組比較，訓練組全天總反應時間和潛伏期延長，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），錯誤反應次數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

訓練14d和21d時，與假手術組比較，對照組學習記憶能力進一步減退。與對照組比較，訓練組學習記憶能力進一步改善，各項測試指標差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。訓練21d時，與假手術組比較，訓練組錯誤反應次數(shù)和潛伏期差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），全天總反應時間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖1、2。

2.2 HE染色觀察結果 低倍鏡下：假手術組大鼠海馬錐體細胞層結構緊密，層次豐富。對照組大鼠海馬神經元明顯受損，CA1區(qū)細胞排列稀疏，細胞線不清晰。訓練組神經元排列較對照組稍整齊。高倍鏡下：假手術組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞形態(tài)規(guī)則，略呈錐形，核呈圓形或橢圓形，核膜清楚，核質染色均勻。對照組和訓練組神經元可見胞體縮小，胞漿嗜酸性，胞核固縮或溶解。在相應時間點進行神經元計數(shù)，訓練7d后，與假手術組比較，對照組和訓練組細胞核完整的神經元明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。訓練14d和21d后，與對照組比較，訓練組神經細胞較對照組明顯增多（P＜0.05），與假手術組比較，訓練組神經細胞數(shù)仍較少（P＜0.05）。見圖3。

圖3 各組大鼠海馬CA1區(qū)正常神經元計數(shù)比較

2.3 各組不同時間點海馬CA1區(qū)BNDF表達的光密度值比較 光鏡下可見BDNF免疫陽性顆粒主要分布在海馬CA1、CA3、DG區(qū)，呈圓形或橢圓形，大小不一，以胞漿著色為主，陽性產物呈棕黃色顆粒狀，部分細胞可見的陽性反應突起。假手術組BDNF免疫陽性神經元相對較少，著色較淺淡。陰性對照用PBS代替一抗，未見陽性產物。訓練7d后，與假手術組比較，訓練組和對照組海馬CA1區(qū)BDNF光密度值升高（P＜0.05）。訓練14d后，訓練組BDNF光密度值升高，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。訓練21d后，訓練組BDNF光密度值進一步升高，與對照組和假手術組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 3組海馬CA1區(qū)BNDF免疫陽性神經元結果比較 （）

表1 3組海馬CA1區(qū)BNDF免疫陽性神經元結果比較 （）

注：與假手術組比較，＃P＜0.05，與對照組比較，＊P＜0.05

組別 光密度值7d 14d 21d訓練組 2.0917±0.7656＃ 9.3721±0.8974＃＊ 15.3176±0.8129＊對照組 1.3062±0.4423＃ 6.7289±0.7427＃ 4.9877±0.6075＃假手術組0.7183±0.5519 0.7029±0.5421 0.7146±0.4271

3 討論

目前已知的與人類認知功能關系密切的大腦組織結構主要有海馬、杏仁體以及額顳葉皮層等，其中海馬及其周圍皮層結構是記憶神經通路的重要組成部分［3］，與人類的學習記憶功能關系最為密切。海馬直接參與了信息的儲存和回憶，且與空間定位的學習記憶有關，是學習記憶等高級神經活動的重要部分。目前大量研究表明，康復訓練對于改善缺血性腦血管病的多種功能障礙有明顯的療效?？祻陀柧毷怯绊懩X功能恢復極為重要的因素。本實驗中應用Y型電迷宮檢測造模前各組大鼠的學習記憶能力一致，均達到學會標準。造模后7d對照組和訓練組學習記憶能力明顯減退，錯誤次數(shù)增多，全天總反應時間和潛伏期延長，與假手術組比較差異有統(tǒng)計學意義。應用Y型電迷宮訓練，與假手術組比較，隨著訓練時間的延長，訓練組的學習記憶能力逐漸改善，而對照組的學習記憶能力逐漸減退，說明全腦缺血后可以造成大鼠的學習記憶能力障礙，而早期進行Y型電迷宮訓練可以改善全腦缺血大鼠的學習記憶能力。

BDNF作為神經營養(yǎng)家族成員之一，對多種神經元具有分化、增殖、營養(yǎng)、成熟的作用，具有增強突觸聯(lián)系、增加學習記憶的功能。有關記憶的研究表明，記憶與突觸前和突觸后的長時程增強效應（long－term potentiation，LTP）明確相關，BDNF能調節(jié)突觸傳遞和突觸可塑性，改變LTP［4］，增強學習記憶功能，因此在研究中將BDNF作為記憶改善的分子標志物。研究發(fā)現(xiàn)應用 Morrsi水迷宮測試BDNF基因敲除的小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠存在學習記憶能力缺損［5］。腦缺血損傷后可促進BDNF的升高，從而形成腦缺血后自我保護機制，但BDNF的升高持續(xù)時間短暫，有研究發(fā)現(xiàn)康復訓練亦可促進腦缺血后BDNF升高，袁學謙等［6］對急性腦梗死患者進行早期康復訓練后，患者血清BDNF、NGF含量治療后較治療前明顯升高，且神經功能缺損程度明顯減少。王風波等［7］對腦損傷仔鼠采用電針聯(lián)合豐富康復訓練進行干預28d后，發(fā)現(xiàn)干預組仔鼠腦皮質BDNF陽性表達明顯高于對照組和非干預組仔鼠。本研究發(fā)現(xiàn)全腦缺血大鼠對照組和訓練組較假手術組海馬CA1區(qū)BDNF表達均增加，但隨著訓練時間延長，對照組BDNF表達有下降趨勢，但訓練組BDNF的表達較對照組明顯增加，同時電迷宮測試結果提示訓練組大鼠的空間學習記憶能力明顯改善。因此，學習記憶訓練可以通過增加BDNF，保護海馬神經元免受進一步損害，或對已受損的神經元修復有促進作用，從而促進全腦缺血大鼠空間記憶能力的改善。

［1］賈建民，賈建平 .大鼠腦反復缺血致不可逆學習障礙的研究［J］.心理學報，1995，27（1）：69－76.

［2］王躍春 .大鼠Y－型迷宮測試法的篩選與優(yōu)化［J］.中國行為醫(yī)學科學，2005，14（1）：50－52.

［3］Laroche S，Davis S，Jay TM.Plasticity at hippocampal to perfrontal cortex synapses：dual roles in working memory and consolidation［J］.Hippocampus，2000，10（4）：438－446.

［4］Mohamd EM，Ahmed HH，Estefan SF，et al.Windows into estradiaol effects in Alzheimer’s disease therphy［J］.Eur Rev Med Pharmacol Sci，2011，15（10）：1 131－1 140.

［5］McDowell KA，Hutchinson AN，Wong－Goodrich SJ，et al.Reduced cortical BDNF expression and aberrant memory in carf knock－out mice［J］.Neurosci，2010，30：7 453－7 465.

［6］袁學謙，王艷，張莉峰，等 .早期康復訓練對急性腦梗死患者血清BDNF、NGF含量及神經功能缺損程度的影響［J］.中國實用神經疾病雜志，2010，13（22）：38－39.

［7］王風波，唐明薇，李曉捷 .電針聯(lián)合豐富康復訓練對腦損傷仔鼠腦皮質腦源性神經營養(yǎng)因子表達的影響［J］.中國康復理論與實踐，2012，8（18）：717－720.