姚金鳳，白 露，宋亞芳，薛 明

(首都醫(yī)科大學(xué)1.燕京醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，北京 101300;2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，北京 100069)

多肽是由氨基酸通過肽鍵相連構(gòu)成的一類化合物，是生物體內(nèi)普遍存在的化學(xué)活性物質(zhì)。迄今為止，生物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)的多肽達(dá)數(shù)萬種，而且大多具有生理活性，如生命活動(dòng)中的細(xì)胞分化、神經(jīng)激素與遞質(zhì)調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)及腫瘤發(fā)生等生理、病理過程均與活性多肽密切相關(guān)。多肽類藥物藥理活性強(qiáng)、療效高，在維持機(jī)體正常功能中發(fā)揮著重要的作用。因此，利用肽類作為治療藥物已越來越引起國(guó)際醫(yī)藥工業(yè)界的興趣［1］，包括利用一些合成肽作為內(nèi)源性肽的類似物，或合成天然活性肽的衍生物［2］。自1982年胰島素作為第一個(gè)來源于生物技術(shù)的多肽類藥物上市以來，伴隨著生物化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展及多肽合成技術(shù)的日益成熟，基于肽和蛋白質(zhì)類的藥物已占臨床用藥的相當(dāng)大一部分，如已獲FDA批準(zhǔn)的多肽類藥物有:抗腫瘤藥地尼白介素2、門冬酰胺酶和培門冬酶;黃體生成素釋放激素(LHRH)類似物阿巴瑞克、西曲瑞克、亮丙瑞林和戈舍瑞林;抗貧血藥促紅細(xì)胞生成素-α、重組人紅細(xì)胞生成素-α;胰島素類似物賴脯胰島素、門冬胰島素和甘精胰島素等等［3］。

然而，多肽類藥物在化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化特性上又不同于小分子藥物，其基本單元為氨基酸殘基，其共價(jià)結(jié)合方式與蛋白質(zhì)相同，因此多肽是許多蛋白水解酶的天然底物，胃腸道內(nèi)的固有肽酶和蛋白酶是肽類和蛋白質(zhì)代謝的最有效工具。高胃腸道酶活性和胃腸粘膜的低通透性導(dǎo)致多肽類藥物口服給藥后通常無治療活性［4］。因此，盡管一般適用于小分子的藥代動(dòng)力學(xué)原理同樣適用于多肽類藥物，但由于多肽藥物具有相對(duì)分子質(zhì)量大、不易透過生物膜、易在體內(nèi)酶解、其降解途徑與蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)素和(或)特殊調(diào)節(jié)內(nèi)源肽相似等特點(diǎn)，所以在藥物開發(fā)過程中必須考慮與生物分析和藥物代謝動(dòng)力學(xué)有關(guān)的許多限制和缺陷。此外，由于肽類藥物與內(nèi)源性物質(zhì)和受體以及調(diào)節(jié)反饋之間存在密切的相互作用，所以其藥效動(dòng)力學(xué)和藥代動(dòng)力學(xué)的關(guān)系往往比較復(fù)雜。本文就近年來國(guó)內(nèi)外有關(guān)多肽類藥物的代謝研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 多肽類藥物酶的代謝位點(diǎn)

一般蛋白和多肽類藥物通過與內(nèi)源性或膳食蛋白質(zhì)一樣的分解代謝途徑被消除，即主要是受體內(nèi)蛋白酶的作用而被水解代謝。按照酶切位置，可以把蛋白酶分為內(nèi)肽酶和外肽酶(包括氨肽酶和羧肽酶)［5］。肽和蛋白質(zhì)的水解通常起始于內(nèi)肽酶，它作用于蛋白質(zhì)的中間部分，酶解產(chǎn)生的寡肽可進(jìn)一步被外肽酶降解。蛋白質(zhì)的最終代謝產(chǎn)物，即氨基酸和二肽進(jìn)入內(nèi)源性氨基酸庫(kù)被重新利用，用于重新合成結(jié)構(gòu)性或功能性機(jī)體蛋白質(zhì)［6］。

蛋白水解酶對(duì)多肽的水解反應(yīng)往往具有一定的特異性或選擇性，即可選擇性地作用于某些氨基酸位點(diǎn)［7］。如胃蛋白酶只能水解肽鏈中由芳香族氨基酸的氨基和酸性氨基酸的羧基形成的肽鍵;胰蛋白酶主要作用于堿性氨基酸的羧基形成的肽鍵;糜蛋白酶主要水解芳香性氨基酸;彈性蛋白酶主要水解脂肪族氨基酸羧基形成的肽鍵;氨肽酶主要水解寡肽的氨基末端肽;羧肽酶A和B分別水解中性和堿性氨基酸的羧基末端肽［8］;二肽基肽酶IV(DPPIV)有利于N-端的第2位氨基酸殘基為Ala或Pro的降解，在此位點(diǎn)用其他氨基酸殘基替代可以減少肽的降解［9］。蛋白酶亞類中每一個(gè)具體酶對(duì)肽的水解也具有作用特異性，如谷氨酰胺氨肽酶(EC number 3.4.11.7)主要水解 N-端的 Glu 殘基，而氨肽酶B(EC number 3.4.11.6)則水解寡肽 N-末端的 Arg 和 Lys殘基，有關(guān)蛋白酶的作用特異性和組織分布已有比較詳細(xì)的報(bào)道［10］。

2 多肽類藥物在組織器官中的代謝

蛋白水解酶在機(jī)體內(nèi)廣泛分布，因此，具有廣泛的多肽類藥物代謝能力的部位不僅包括肝、腎和胃腸道組織，也包括肺、血液和血管內(nèi)皮、皮膚及其他組織和器官。各組織和器官因所分布的蛋白酶種類不同、對(duì)肽類藥物的攝入方式不同，所以對(duì)多肽代謝的速率和程度也有所不同。

2.1 肝臟代謝肝臟在多肽類藥物代謝過程中發(fā)揮著十分重要的作用。在肝臟代謝之前，肝細(xì)胞首先要攝入多肽。對(duì)于小肽，如果肽分子本身有足夠的疏水性，那么它們就可以通過被動(dòng)擴(kuò)散跨過肝細(xì)胞膜;分子較大的蛋白質(zhì)則可以通過載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi);而多數(shù)水溶性的和不能通過特異機(jī)制攝入的多肽，則可通過內(nèi)吞作用進(jìn)入肝細(xì)胞。另有證據(jù)表明，存在于肝細(xì)胞膜上的一種受體，即低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白在組織型纖溶酶原激活劑的代謝中起重要作用［11］。Liao等［12］證實(shí)，鮭魚降鈣素在肝勻漿中溫孵時(shí)，起始斷裂位點(diǎn)在His17-Lys18和Val8-Leu9，其余降解產(chǎn)物基本由外肽酶(氨肽酶或羧肽酶)對(duì)主要降解產(chǎn)物或鮭魚降鈣素原型的代謝作用而產(chǎn)生。

2.2 腎臟的代謝消除腎臟在多肽的清除過程中具有特殊作用。腎臟的底物、生長(zhǎng)因子、酸堿平衡及腎功能變化都會(huì)引起多肽代謝的不同。對(duì)于非口服及內(nèi)源性肽和蛋白類藥物，如果多肽或蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量小于腎小球的濾過極限(～60 ku)，那么腎臟就是其主要消除器官。研究重組人胰高血糖素類肽-1(7-36)［rhGLP-1(7-36)］的藥動(dòng)學(xué)發(fā)現(xiàn)，給大鼠皮下注射［125I］rhGLP-1(7-36)10 min后，血漿藥物濃度達(dá)峰，降解物迅速出現(xiàn)，此時(shí)腎臟中的總放射性濃度最高，提示腎臟對(duì)從循環(huán)中清除［125I］rhGLP-1(7-36)或其代謝物有重要作用［13］。

肽類和小分子蛋白質(zhì)的腎代謝主要是通過以下兩種機(jī)制介導(dǎo)的:(1)經(jīng)腎小球?yàn)V過的大分子多肽，通過胞吞和溶酶體降解清除，最后水解成小肽碎片和氨基酸［14］。(2)經(jīng)腎小球?yàn)V過的小分子多肽被近端腎小管管腔內(nèi)的刷狀邊緣膜中的肽鏈端解酶水解成氨基酸，再經(jīng)特異性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)被重新吸收進(jìn)入體循環(huán)，也可能是先斷裂成小肽，再轉(zhuǎn)運(yùn)至近曲小管上皮細(xì)胞內(nèi)，在胞內(nèi)水解。這種機(jī)制消除的藥物如質(zhì)子驅(qū)動(dòng)的肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PEPT1和PEPT2［15］。最近的研究對(duì)肽類藥物在腎臟內(nèi)代謝時(shí)的酶解位點(diǎn)有一些報(bào)道，如Spiegeleer等［16］研究了碘化的肥胖抑制素肽在體外血漿、肝和腎中的代謝穩(wěn)定性，結(jié)果顯示，與未修飾的原型肽相比，碘化的肽酶解位點(diǎn)與生物基質(zhì)和與碘原子相連的氨基酸殘基有關(guān)，酶解發(fā)生在距離碘原子較遠(yuǎn)的肽鍵上，而與碘原子相連的附近肽鍵的酶解則受到限制。Serada等［17］報(bào)道，給大鼠皮下注射特里帕肽醋酸酯后，其藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果顯示，腎臟在其分布和代謝中起重要作用，但在其消除中的作用卻不明顯。

2.3 胃腸道代謝蛋白多肽類藥物一般口服給藥無效，這主要是胃腸道內(nèi)存在著大量降解多肽的酶類，主要有:(1)胃腸道腔內(nèi)酶，包括胃蛋白酶、胰蛋白酶、α-糜蛋白酶、彈性酶以及羧肽酶A和B;(2)黏膜細(xì)胞酶，主要指與刷狀緣膜結(jié)合的酶類;(3)刷狀緣胞液酶，包括氨基三肽酶、脯氨酸肽酶、脯氨酰肽酶、二肽酶及肌肽酶等。

其中胰蛋白酶是胃腸道主要的蛋白酶。乳鐵傳遞蛋白(lactoferrin，LF)是存在于牛奶和其他體液中的一種蛋白，有重要的生物學(xué)作用。作為一種食物，乳鐵傳遞蛋白必須在胃腸道環(huán)境中穩(wěn)定或者產(chǎn)生生物活性碎片才能發(fā)揮作用。用人胃液或腸液模擬胃和十二指腸環(huán)境消化乳鐵傳遞蛋白，結(jié)果顯示，高濃度的胃液和腸液或快速降低其pH值為2.5，能引起LF在模擬胃液中完全降解;當(dāng)慢慢降低其pH值為2.5或4.0時(shí)，LF能部分抵抗胃液的消化。對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)含有脯氨酸及鄰位疏水的氨基酸殘基能限制酶解過程。進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)分析顯示，幾乎所有的酶解位點(diǎn)都位于表面，主要存在于LF非糖基化的部分。而且，用人蛋白酶和非人蛋白酶消化牛LF(bLF)能產(chǎn)生不同的肽片段［18］。

2.4 肺代謝多肽和蛋白類藥物在肺泡和呼吸道中降解的程度尚不清楚，但是，已有報(bào)道證明了這一途徑對(duì)于肺部蛋白消除的重要性。研究證明，肺部存在多種蛋白酶和肽酶，雖然這些蛋白酶的功能尚未知，但其中一些酶參與了蛋白質(zhì)的降解。研究者在呼吸道內(nèi)發(fā)現(xiàn)了高濃度的游離氨基酸，它們可能是蛋白質(zhì)降解的產(chǎn)物?，F(xiàn)已證明，在呼吸道和肺泡上皮細(xì)胞的管腔膜上存在氨基酸、肽和糖的轉(zhuǎn)運(yùn)體，這些轉(zhuǎn)運(yùn)體可能參與蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物從呼吸道的清除［19］。Liao等［12］研究了人甲狀旁腺素(hPTH)在大鼠肝、腎和肺勻漿中的代謝，發(fā)現(xiàn)hPTH在這3種體系中的主要斷裂位點(diǎn)基本一致，均為L(zhǎng)eu15-Asn16，提示該激素在勻漿體系中的降解主要由糜蛋白酶樣內(nèi)肽酶酶切，繼而由外肽酶(氨肽酶和羧肽酶)對(duì)主要降解片段或hPTH原型進(jìn)一步酶切。我們通過研究LHRH拮抗劑十肽在大鼠肺勻漿中的代謝，證明所研究的5種新型十肽在大鼠肺勻漿中溫孵4 h后，原型藥物的保留百分率在20%～70%，也說明了肺在多肽類藥物代謝中的作用［20］。

2.5 其他組織除了以上主要代謝組織器官外，血漿、皮膚等組織在多肽類的代謝中也發(fā)揮著重要作用。在皮膚角質(zhì)層、表皮和真皮層中都存在一些內(nèi)肽酶(如脫氨酶和酯酶)和外肽酶(如氨肽酶)，肽類在皮膚真皮層能被酶快速代謝。Park等［21］用LC-MS/MS方法測(cè)定了用于抗衰老的膠原五肽在大鼠皮膚勻漿中的穩(wěn)定性，證實(shí)該五肽可逐步被氨肽酶降解，這對(duì)于該類藥物的經(jīng)皮吸收給藥是一個(gè)需要克服的障礙。另外，受體介導(dǎo)的內(nèi)攝作用在多肽代謝中也發(fā)揮重要作用。多肽和蛋白類藥物絕大部分都能與受體結(jié)合，從而導(dǎo)致受體介導(dǎo)的吸收及相繼的胞內(nèi)代謝消除，這有別于傳統(tǒng)的小分子藥物，一般小分子藥物的受體結(jié)合導(dǎo)致的藥物消除可以忽略不計(jì)。

3 影響多肽類藥物代謝的因素和提高代謝穩(wěn)定性的策略

多肽藥類物在體內(nèi)代謝穩(wěn)定性差，降解迅速，原型藥物在體內(nèi)代謝快，消除半衰期較短以及存留時(shí)間很短，生物利用度低。如FDA批準(zhǔn)的溶栓藥阿替普酶(activase)，靜脈注射時(shí)半衰期小于5 min;重組人高血糖素(glucogon)，在靜脈注射、皮下注射和肌肉注射時(shí)半衰期為8～18 min;而甲狀旁腺激素類藥物特里帕特(forteo)在皮下注射時(shí)半衰期只有5 min。因此，提高肽類藥物的體內(nèi)代謝穩(wěn)定性、存留時(shí)間和生物利用度是目前國(guó)內(nèi)外亟待解決的問題。

影響蛋白多肽類藥物代謝消除速率的因素主要包括分子質(zhì)量和分子的理化性質(zhì)如分子大小、親脂性、糖基化模式、二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)等。近年來已有許多學(xué)者進(jìn)行了提高肽類藥物生物利用度的研究，如Ma等［22］采用甲基、羥甲基、4-氨基丁基和3-羧基丙基分別取代α-氨氧基肽AxyP1的異丁基側(cè)鏈，合成了一系列該肽的類似物，從而使其在腸和肝中的穩(wěn)定性提高了8～12倍。

3.1 特定氨基酸序列由于蛋白酶和肽酶對(duì)多肽的水解往往具有一定的特異性，可選擇性地作用于某些氨基酸的特定位點(diǎn)，如果多肽中的氨基酸殘基恰好是某些蛋白酶的易作用靶點(diǎn)，其就很容易受蛋白酶的代謝失活。如二肽基肽酶IV(DPPIV)是一種體內(nèi)廣泛分布的膜結(jié)合色氨酸氨肽酶，能夠酶解血漿中的多種蛋白激素，尤其是以Ala或Pro作為N-端第2位氨基酸的多肽或蛋白就更容易被其水解。一個(gè)典型例子是胰高血糖素樣肽1(GLP-1)，受此酶的水解導(dǎo)致其在人體的半衰期只有 0.9 min［23］。

針對(duì)蛋白酶對(duì)特定氨基酸殘基水解的特異性導(dǎo)致的肽穩(wěn)定性降低，可以采取以下措施提高代謝穩(wěn)定性:(1)N-端和C-端封閉;(2)D-氨基酸替代;(3)非天然氨基酸側(cè)鏈替代;(4)非天然肽骨架替代，如氮雜氨基酸、N-甲基氨基酸、偽肽連接等;(5)限制肽，如環(huán)化、側(cè)鏈限制、Cα-烷基化;(6)擬肽，如N-烷基甘氨酸;(7)β和γ氨基酸替代。

Dong等［24］用特異性多位點(diǎn)N-甲基化修飾次氯化血紅素肽，增加了蛋白酶或肽酶與肽結(jié)合時(shí)的空間障礙，阻止肽和酶結(jié)合部位之間形成氫鍵，而這種氫鍵是酶識(shí)別底物所必需的，例如，有底物存在時(shí)，羧肽酶活性中心的水解活性被激活，其構(gòu)象會(huì)發(fā)生明顯變化。然而，因?yàn)樵诤线m的位置酶與次血紅素六肽甲基化衍生物相連，使得酶的活性要比結(jié)合原型藥物時(shí)難以激活，因此增加了修飾產(chǎn)物的酶降解穩(wěn)定性。

Taiji等［25］用氨基酸替代合成了代謝穩(wěn)定的腫瘤遷移抑制素。腫瘤遷移抑制素蛋白是含有54個(gè)氨基酸的多肽，是G-蛋白偶聯(lián)受體KISS1R的配體，在很多內(nèi)分泌和性腺生成障礙組織調(diào)節(jié)生殖和細(xì)胞遷移通路中起重要作用。N-端切除的十肽腫瘤遷移抑制素(45-54)有3～10倍高的受體親和能力和細(xì)胞內(nèi)鈣離子激活活性，但是在血清中會(huì)快速失活。采用47、50和51位選擇性替代設(shè)計(jì)和合成KISS1R十肽類似物，即用氮雜甘氨酸取代了甘氨酸，51位上甘氨酸中的α-C原子用N原子取代，體外小鼠血清中的穩(wěn)定性結(jié)果顯示，這種取代提高了Phe50-Gly51以及Gly5-Leu52之間的酰胺鍵的穩(wěn)定性。用其他氨基酸如絲氨酸、蘇氨酸、β-(3-吡啶)丙氨酸和D-色氨酸取代47位的色氨酸所得到的類似物在鼠血清中具有很好的穩(wěn)定性。其中，D-Trp47取代的類似物不僅具有很高的代謝穩(wěn)定性，而且具有很好的KISS1R競(jìng)爭(zhēng)活性。

3.2 分子質(zhì)量分子質(zhì)量是影響肽和蛋白質(zhì)代謝的重要因素，其代謝速率、消除部位和代謝機(jī)制都可隨著分子質(zhì)量的變化而變化。代謝速率通常隨著分子質(zhì)量的降低而增加，順序依次是:大蛋白質(zhì)＜小蛋白質(zhì)＜肽。對(duì)于分子質(zhì)量小于1 000 u的小肽，結(jié)構(gòu)和親脂性是影響代謝消除的主要因素，主要消除部位是肝;分子質(zhì)量在1 000～5 000 u之間的肽，分子質(zhì)量則成為影響其代謝消除的主要因素，主要代謝部位為腎，不同代謝機(jī)制之間可以交叉重疊。如前所述，分子質(zhì)量小于60 ku的游離極性分子很快被腎小球?yàn)V過進(jìn)入尿液。低分子質(zhì)量、可溶性分子每次通過腎臟的清除率約為25%，所以對(duì)于游離在血漿中的肽，即便是對(duì)蛋白酶穩(wěn)定，也會(huì)因?yàn)榉肿哟笮『臀锢硇再|(zhì)而被快速清除［9］。

聚乙二醇(PEG)化增加肽的有效分子量是減少腎排泄的常用方法。其保護(hù)肽的可能機(jī)制為:(1)保護(hù)肽不受免疫監(jiān)視;(2)增大分子量使肽不被腎小球?yàn)V過而清除［9］;(3)通過增加立體障礙，保護(hù)肽不受蛋白酶的降解［10］。其中減少腎小球的濾過是主要機(jī)制。Zhu等［26］用Arg-Gly-Asp修飾內(nèi)皮抑素合成出一種具有抗腫瘤活性的抗血管生成肽HM-3，然后以甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亞胺碳酸酯(分子質(zhì)量20 ku)修飾HM-3，修飾后的產(chǎn)物PEG20k-HM-3在大鼠血漿中溫孵48 h后仍保留 90.81%不被降解，132 h后仍有72.78%未被代謝，而未修飾前的原型藥物HM-3在同樣條件下溫孵25 min后即被完全代謝。說明聚乙二醇修飾后的肽在血漿中的穩(wěn)定性明顯提高。

3.3 親脂性增加肽的疏水性可以引起肽在體內(nèi)貯存以及與細(xì)胞膜和全身疏水載體蛋白可逆結(jié)合。因?yàn)榻Y(jié)合疏水載體蛋白(如血清白蛋白，分子量66 ku)而引起分子質(zhì)量增大，所以肽不易被腎濾過消除，也不易被循環(huán)系統(tǒng)中的膜結(jié)合蛋白酶代謝，就被重新釋放入血液，從而延長(zhǎng)了在體內(nèi)的作用時(shí)間［9］。Jordan等以腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BNDF)的3D結(jié)構(gòu)為模板，設(shè)計(jì)合成了頭尾環(huán)化的低分子量五肽P1，作為BNDF類似的激動(dòng)劑，P1在體外能促進(jìn)小雞感覺神經(jīng)元的存活，并對(duì)血漿蛋白酶降解具有高度穩(wěn)定性。以此低分子五肽為先導(dǎo)化合物，用烷基酰胺取代而合成的疏水類似物P6，在小鼠血漿中溫孵的半衰期可超過24 h，并具有良好的透膜性［27］。

3.4 空間構(gòu)象多肽的空間構(gòu)象在很大程度上影響其對(duì)蛋白酶的穩(wěn)定性。為了獲得酶解穩(wěn)定性的多肽，可以采用環(huán)化、糖基化、引入小分子化合物或內(nèi)酰胺橋以及形成二硫鍵等方法限制或穩(wěn)定肽的空間構(gòu)象。

3.4.1 環(huán)化 環(huán)化能夠?qū)崿F(xiàn)肽的N-和(或)C-端修飾、減少肽結(jié)構(gòu)的靈活性、減少酶對(duì)肽的降解，而不影響肽的活性和特異性。已有研究表明，雙環(huán)肽比具有相同氨基酸序列的線性肽的酶解穩(wěn)定性更好［28］。肽骨架環(huán)化可增強(qiáng)分子內(nèi)氫鍵，減少與水溶性溶劑之間的潛在氫鍵，是提高抗酶解能力的有效方法。富含二硫鍵的肽尤其適用于這種方法，因?yàn)樵诃h(huán)化過程中可以利用半胱氨酸殘基進(jìn)行自然化學(xué)連接。例如，APETx2是一種從?？蟹蛛x出來的毒素肽，用于治療慢性炎癥性疼痛。具有42個(gè)氨基酸殘基，其中有6個(gè)半胱氨酸殘基。在結(jié)構(gòu)上 N-端和 C-端的空間距離很小(10.8±2.4)?，這使得該化合物能更好地通過骨架環(huán)化提高其穩(wěn)定性。通過環(huán)化分別合成了含有由6、7和8個(gè)氨基酸組成的環(huán)的類似物。用胰蛋白酶消化和模擬胃液考察其降解穩(wěn)定性，胰蛋白酶是特異性酶，能使APETx2的C-端Lys10，Arg24和(或)Arg31水解，而胃蛋白酶特異性較弱，較易水解疏水性和芳香族的氨基酸殘基，對(duì)APETx2中的11個(gè)位點(diǎn)有潛在的水解能力(即羧基端的 Ala3、Ile12、Tyr13、Trp14、Phe15、Tyr16、Tyr26、Tyr32、Phe33、Leu34 和 Ala41)。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，盡管未環(huán)化前的原型肽在結(jié)構(gòu)上折疊緊密，而且有二硫鍵對(duì)構(gòu)象的穩(wěn)定作用，但其抗胰蛋白酶和胃蛋白酶酶解的能力卻明顯弱于骨架環(huán)化后的3個(gè)肽，原型肽在胰蛋白酶和胃蛋白酶的半衰期分別為2.8 h和5 min，在胰蛋白酶中溫孵48 h后，原型僅存4%沒被降解，而環(huán)化后的肽仍保留70%～80%未被降解。在模擬胃液中，原型肽2 h后被全部降解，環(huán)化肽仍有50%未被降解。兩種酶中的穩(wěn)定性結(jié)果說明，骨架環(huán)化能夠明顯提高肽的穩(wěn)定性［29］。

環(huán)化不僅可以提高肽對(duì)蛋白酶的穩(wěn)定性，也可以減少其他代謝酶對(duì)肽的降解。例如，用香豆素酸環(huán)化阿片肽前藥，從而增加了對(duì)細(xì)胞色素P450氧化代謝的穩(wěn)定性。阿片肽的環(huán)狀前藥H-Tyrd-AlaGlyPhed-LeuOH(DADLE)能被細(xì)胞色素P450代謝，這一代謝特征限制了其口服給藥的應(yīng)用。為了設(shè)計(jì)代謝穩(wěn)定的DADLE環(huán)狀前藥，用香豆素酸環(huán)合得到DADLE類似物(CADADLE)，這一結(jié)構(gòu)中含有易被CYP450氧化的修飾過的氨基酸殘基。通過對(duì)比研究DADLE及其環(huán)化類似物CADADLE在大鼠肝微粒體(RLM)、豚鼠肝微粒體(GPLM)、人肝微粒體(HLM)和人重組細(xì)胞色素P450 3A4(hCYP3A4)中的代謝穩(wěn)定性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)阿片肽及其環(huán)化前藥與RLM、GPLM和HLM共同溫孵后，在氨基酸側(cè)鏈上都發(fā)生了單羥基化反應(yīng);當(dāng)與hCYP3A4共同溫孵時(shí)，DADLE發(fā)生了類似的氧化代謝，相比之下，環(huán)化后的DADLE類似物則不是CYP450同工酶的底物，說明用香豆素酸環(huán)化后，增加了阿片肽前藥對(duì)細(xì)胞色素P450氧化代謝的穩(wěn)定性［30］。

3.4.2 糖基化 糖基化修飾不僅可以影響多肽的空間結(jié)構(gòu)，從而增強(qiáng)其對(duì)蛋白酶的穩(wěn)定性，而且可以與PEG化聯(lián)合修飾多肽，起到減少多肽的抗原性的作用。例如，TY027(Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Met-Pro-Leu-Trp-NH-3＇，5＇-Bzl(CF(3))(2))是具有δ/μ-阿片受體激動(dòng)劑和神經(jīng)激肽-1受體拮抗劑的雙功能化合物，在大鼠血清中的半衰期是4.8 h。為了獲得代謝更穩(wěn)定的具有止痛功能的阿片肽衍生物，Yamamoto等［31］把O-β-糖基化的絲氨酸(Ser(Glc))引入其中而得到類似 物 (Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Nle-Pro-Leu-Ser(Glc)-Trp-NH-3＇，5＇-Bzl(CF(3))(2))。該類似物具有兩個(gè)β-翻轉(zhuǎn)的明確構(gòu)象以及更有效的雙功能活性，代謝穩(wěn)定性明顯提高，在大鼠血漿中溫孵24 h后，仍有70%±9% 的原型未被代謝。

3.4.3 引入小分子化合物 在多肽結(jié)構(gòu)中引入小分子化合物或橋式結(jié)構(gòu)可以加固其空間結(jié)構(gòu)，保護(hù)多肽不受蛋白酶的降解。例如，恩夫韋地(enfuvirtide)是一個(gè)含有36個(gè)氨基酸的多肽，能作用于病毒融合結(jié)構(gòu)而抑制人免疫缺陷病毒(HIV-1)的感染，但其體內(nèi)穩(wěn)定性和生物利用度都很差。用所謂“碳化氫雙釘針”技術(shù)將一個(gè)起穩(wěn)定作用的小分子化合物植入恩夫韋地分子中，能夠加固該分子中的整體α-螺旋的結(jié)構(gòu)，使之抵抗蛋白酶解，與釘針臨近的限制性位點(diǎn)的肽裂解被完全阻止［32］。

胰高血糖素樣肽(GLP-1)具有降低血糖水平的作用，是用于治療二型糖尿病的有效藥物。但它在體內(nèi)容易受二肽基肽酶IV(DPPIV)和中性內(nèi)肽酶(neprilysin，NEP，EC3.4.24.11)的降解而失活。二肽酶抑制劑可以用來解決DPPIV的快速代謝問題，而中性內(nèi)肽酶因?yàn)樽饔糜贕LP-1序列上的多個(gè)位點(diǎn)，所以抑制其酶解作用比較困難。為克服這一難題，Murage等［33］合成了多個(gè)內(nèi)酰胺橋構(gòu)象限制的GLP-1類似物，用來同時(shí)穩(wěn)定N-和C-端的α-螺旋。結(jié)果顯示，內(nèi)酰胺橋通過固定α-螺旋結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)了與受體的相互作用，提高了GLP-1對(duì)受體的活化能力(超過5倍);而且可以保護(hù)GLP-1不易被酶降解，使其半衰期超過96 h。

4 結(jié)語(yǔ)

由于多肽類藥物結(jié)構(gòu)與小分子藥物本質(zhì)上的不同，導(dǎo)致其具有生物半衰期短、表觀分布容積小、首過效應(yīng)顯著、生物利用度低等特點(diǎn)，所以對(duì)多肽類藥物的代謝和解釋常面臨更多的挑戰(zhàn)，并且與小分子候選藥物相比需要更多的資源。其中最主要的挑戰(zhàn)是:多肽類藥物口服生物利用度低、難以從大量相似的內(nèi)源性分子中鑒定出來進(jìn)行量化。解決這一難題的策略除了上述所提到的化學(xué)結(jié)構(gòu)的修飾外，通過處方手段克服生理障礙也是目前研究的熱點(diǎn)，如聯(lián)合應(yīng)用蛋白酶抑制劑和吸收促進(jìn)劑，增強(qiáng)多肽在體內(nèi)的穩(wěn)定性和腸吸收;應(yīng)用納米制劑和脂質(zhì)體等緩控釋劑型、各種載體輸送系統(tǒng)以解決多肽類的口服輸送問題;改變給藥途徑，如采用鼻腔給藥和吸入給藥。

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