周 靜 (新疆伊犁州婦幼保健院，新疆 伊犁 835000)

宮頸癌是比較常見(jiàn)的婦女惡性腫瘤之一，近年來(lái)該病在我國(guó)的發(fā)病率有增高趨勢(shì)，發(fā)病年齡日趨年輕化。按照癌細(xì)胞病理特點(diǎn)的分類，宮頸癌分為鱗狀細(xì)胞癌(80% ～90%)、腺癌(10%-15%)和其他腺鱗癌〔1〕。人乳頭瘤病毒(HPV)是一種球形DNA病毒，屬于乳多空病毒科的乳頭瘤空泡病毒A屬，能引起人體皮膚黏膜的鱗狀上皮增殖。目前高危型(HR-HPV)持續(xù)感染被認(rèn)為是宮頸癌的確切致病病毒〔2〕。增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)大部分存在于增殖細(xì)胞的細(xì)胞核中，是細(xì)胞細(xì)胞合成期必不可少的因子，亦是增殖期特異性表達(dá)的核蛋白。nm23是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)移抑制基因，其異常表達(dá)與多種腫瘤的轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)〔3〕。本文將病灶組織HPV、PCNA和nm23檢測(cè)應(yīng)用于宮頸癌分型。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇我院2009年4月至2012年4月手術(shù)切除宮頸癌的患者共184例。年齡61～77〔平均(65.6 ±4.8)〕歲。其中鱗狀細(xì)胞癌125例、腺癌43例和其他腺鱗癌16例。對(duì)照組30例為正常宮頸組織切片。所有病例手術(shù)切除前均未行放療及化療，樣本檢查前24 h內(nèi)禁止性生活，3 d內(nèi)無(wú)陰道內(nèi)沖洗、上藥，檢查前不進(jìn)行醋酸或碘液涂抹。

1.2 方法

1.2.1 HPV檢測(cè)方法

1.2.1.1 檢測(cè)材料 采用美國(guó)愛(ài)迪旺斯醫(yī)療科技有限責(zé)任公司生產(chǎn)的賽泰-細(xì)胞/組織HPV檢測(cè)試劑盒;常規(guī)試劑磷酸鹽緩沖液(PBS)、復(fù)染試劑等，來(lái)自本院病理研究室。

1.2.1.2 檢測(cè)方法 (1)取樣使用一次性宮頸脫落細(xì)胞采集器，將其放入宮頸口處，單方向旋轉(zhuǎn)4～5周以獲得足量的上皮細(xì)胞樣本，取出后放入樣本管中充分?jǐn)嚢琛?2)采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)樣本管中子宮頸細(xì)胞核中濃度低于0.01 pg(10～12 g)的HPV殼蛋白的抗原，僅有一個(gè)被染色的細(xì)胞核呈紅色即可做出陽(yáng)性診斷，具體實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.2 PCNA檢測(cè)方法

1.2.2.1 檢測(cè)材料 鏈霉親合素-復(fù)合物(SABC)試劑盒、鼠抗增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)單克隆抗體、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑等均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;常規(guī)試劑(PBS、復(fù)染試劑等)，來(lái)自本院病理研究室。

1.2.2.2 檢測(cè)方法 手術(shù)切除的病理組織樣本以甲醛(10%中性)固定、常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片厚度在4～5 μm，再用脫臘和水化。以已知陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作陰性對(duì)照，按試劑盒說(shuō)明操作進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，顯微鏡下觀察結(jié)果。PCNA以細(xì)胞核出現(xiàn)清晰的棕褐色為陽(yáng)性表達(dá)。

1.2.3 nm23檢測(cè)方法

1.2.3.1 檢測(cè)材料 SABC試劑盒、nm23鼠抗單克隆抗體、DAB顯色劑等均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;常規(guī)試劑(PBS、復(fù)染試劑等)，來(lái)自本院病理研究室。

1.2.3.2 檢測(cè)方法 手術(shù)切除的病理組織樣本以甲醛(10%中性)固定、常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片厚度在4～5 μm，再用脫臘和水化。以已知陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作陰性對(duì)照，按試劑盒說(shuō)明操作進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，顯微鏡下觀察結(jié)果。nm23蛋白以胞漿出現(xiàn)棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)。

1.3 評(píng)分方法 每張樣本切片由2名醫(yī)師雙盲觀測(cè)10個(gè)視野(×400)，陽(yáng)性表達(dá)率用1 000個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)表示，采用雙評(píng)分半定量法分別對(duì)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)評(píng)分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SSPS12.0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 正常宮頸組織和宮頸癌鱗狀細(xì)胞癌、腺癌和其他宮頸癌的HPV表達(dá)差異 HPV在宮頸鱗癌、宮頸腺癌、其他宮頸癌患者陽(yáng)性表達(dá)率分別為91.2%、93.4%、93.7%，與正常宮頸組織(6.3%)比較存在明顯差異(P＜0.05)。

2.2 正常宮頸組織和宮頸癌鱗狀細(xì)胞癌、腺癌和其他宮頸癌的PCNA表達(dá)差異 PCNA在宮頸鱗癌患者陽(yáng)性表達(dá)率達(dá)84.80%，在宮頸腺癌患者達(dá)25.00%，在其他宮頸癌患者達(dá)18.75%，均高于正常宮頸組織(6.6%)(P＜0.05);此外，PCNA在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中的陽(yáng)性表達(dá)率與正常宮頸組織、腺癌和其他宮頸癌有明顯差異 (P＜0.05)。

2.3 正常宮頸組織和宮頸癌鱗狀細(xì)胞癌、腺癌和其他宮頸癌的nm23表達(dá)差 nm23在宮頸鱗癌、宮頸腺癌、其他宮頸癌患者陽(yáng)性表達(dá)率分別為45.6%、41.8%、43.3%，與正常宮頸組織(76.7%)比較存在明顯差異(P＜0.05)。

3 討論

宮頸癌是婦科常見(jiàn)的惡性腫瘤，是鱗狀上皮內(nèi)瘤由低度向高度發(fā)展，最后惡化到浸潤(rùn)癌的復(fù)雜病理過(guò)程，癌基因的激活及抑癌基因的失活是細(xì)胞癌變的分子基礎(chǔ)，其發(fā)生與轉(zhuǎn)移與細(xì)胞增殖活性及某些基因突變有關(guān)〔4〕。宮頸癌多發(fā)生在25～40歲，每年新增病例50余萬(wàn)，近年來(lái)該病有年輕化的趨勢(shì)〔5〕。按照癌細(xì)胞病理特點(diǎn)的分類，分為鱗狀細(xì)胞癌(80% ～90%)、腺癌(10%～15%)和其他腺鱗癌。宮頸癌分型與癌病變的分子標(biāo)志物有很大的聯(lián)系，分析宮頸癌病理變化過(guò)程中分子標(biāo)志物的臨床實(shí)驗(yàn)參數(shù)將有助于更好地理解宮頸癌的病理變化過(guò)程，確診宮頸癌的分型，根據(jù)不同的宮頸癌分型臨床采取適合的治療方案，提高療效，降低死亡率。

HPV是一種雙鏈閉環(huán)小DNA病毒，屬于乳頭瘤病毒科，具有種屬特異性的嗜上皮生物特性。流行病學(xué)研究表明，HPV感染與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)，現(xiàn)已知20余種與癌癥相關(guān)的HPV型別，根據(jù)HPV與宮頸癌病理變化程度的關(guān)系，可將HPV分為低危型和高危型兩種〔6〕。Feng等〔7〕認(rèn)為HR-HPV持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生的必要條件和首要因素。本文研究顯示90%以上宮頸癌患者受HPV感染，故HPV檢測(cè)數(shù)據(jù)可用于確診是否患有宮頸癌。

PCNA是一種酸性核蛋白，在DNA復(fù)制中作為DNA多聚酶δ的輔助蛋白起著重要作用，不僅可用于檢測(cè)惡性腫瘤的增殖細(xì)胞有效標(biāo)記物，還可用于評(píng)價(jià)腫瘤的增殖指數(shù)和生物學(xué)行為。其含量變化與細(xì)胞的增殖狀態(tài)密切相關(guān)，靜止期細(xì)胞含PCNA的量極少，G1后期細(xì)胞中的PCNA合成增加，S期達(dá)高峰，G2/M期明顯下降。因此PCNA含量可作為反映腫瘤細(xì)胞預(yù)后和增殖程度判斷性指標(biāo)，檢測(cè)惡性腫瘤的增殖細(xì)胞有效標(biāo)記物，并用于評(píng)價(jià)腫瘤的增殖指數(shù)和生物學(xué)行為〔8〕。本研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者PCNA在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中的陽(yáng)性表達(dá)率達(dá)80%以上，與正常宮頸組織、腺癌和其他宮頸癌有明顯差異。故PCNA檢測(cè)數(shù)據(jù)可用于確診是否患有鱗狀細(xì)胞癌。

nm23基因可編碼產(chǎn)生二磷酸核苷激酶(NDPK)，NDPK的主要作用是通過(guò)促進(jìn)微管聚合而參與G蛋白介導(dǎo)的磷脂酰肌醇信號(hào)傳遞途徑，參與細(xì)胞分裂紡錘體的形成，影響細(xì)胞的附著、粘連和活動(dòng)，從而抑制癌變細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)，故是一種與惡性腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因〔9〕。Marone等〔10〕認(rèn)為nm23基因的臨床試驗(yàn)參數(shù)與癌變細(xì)胞浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和惡化程度呈負(fù)相關(guān)，即組織癌變程度越高，則nm23實(shí)驗(yàn)參數(shù)越低，利用這種關(guān)系可將nm23作為判斷治療和預(yù)后的臨床指標(biāo)。本文研究也顯示nm23在宮頸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯比正常宮頸組織低，該差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與上面提及的研究相符。故nm23基因的檢測(cè)數(shù)據(jù)可作為宮頸組織惡變的信號(hào)。

綜上所述，雖然病灶組織HPV、PCNA和nm23檢測(cè)用于宮頸癌分型的應(yīng)用研究目前尚且還處于發(fā)展階段，HPV檢測(cè)數(shù)據(jù)可用于確診患者是否患有宮頸癌，而PCNA檢測(cè)數(shù)據(jù)可用于確診是否患有宮頸癌常見(jiàn)的類型鱗狀細(xì)胞癌，nm23檢測(cè)數(shù)據(jù)則可作為宮頸組織惡變的信號(hào)。

1 鄭巧榮，崔金全.宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌中 TS、PCNA的表達(dá)及其意義〔J〕.中國(guó)婦幼保健，2011;26(7):1083-5.

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4 Mccarthy KS，Miller LS，Cox EB，et al.Correlation of biochemical and immuno-histochemical methods using monoclonal antireceptor antibodies〔J〕.Arch Lab Med，1985;109(6):716-21.

5 張露丹，劉玉玲.HPV L1殼蛋白聯(lián)合HPV分型檢測(cè)在宮頸癌篩查中的價(jià)值探討〔J〕.中國(guó)婦幼保健，2012;27(3):340-2.

6 包 穎，劉 明，朱金福，等.液基細(xì)胞學(xué)和高危型 HPV DNA檢測(cè)在宮頸癌篩查中的相關(guān)性〔J〕.中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2012;7(18):60-1.

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8 Olivares D，Gisbert JP，Pajares JM，et al.Helicobacter pylori infection and gastric macosal epithelial cell apoptosis〔J〕.Rev Esp Enferm Dig，2005;97(7):505-20.

9 郭 晰.PCNA和nm23在宮頸癌中的表達(dá)及其臨床意義〔J〕.臨床醫(yī)藥實(shí)踐，2008;6(1):373-5.

10 Marone M，Scambia G，F(xiàn)errandina G，et al.Nm23 expression in endometrical and cervical cancer:inverse correlation with lymph node involvement and myometrial invasion〔J〕.Br J Cancer，1996;74(6):1063-8.