陳 琰 劉桂鋒 吳 玫 張桂珍 (吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 30042)

據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟(IDF)統(tǒng)計(jì)，目前全球糖尿病患者約3.66億，估計(jì)2030年將增至5.52億，在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，其中2型糖尿病(T2DM)占95%以上〔1〕。T2DM是一種多因素引起的疾病，是由遺傳易感性和環(huán)境因素復(fù)雜的相互作用而導(dǎo)致的，遺傳因素在發(fā)病中起著非常重要的作用〔2〕。近年來隨著全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)結(jié)果的相繼報(bào)道和單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析技術(shù)的發(fā)展，至今已發(fā)現(xiàn)上百個(gè)常見基因變異與T2DM密切相關(guān)，但糖尿病的病因及發(fā)病機(jī)制尚不能完全闡明。因此，利用高通量、高效率、低成本、操作簡(jiǎn)便的SNP分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)糖尿病易感基因并對(duì)其深入研究，為T2DM的早期預(yù)測(cè)以及尋找新的臨床治療靶標(biāo)具有十分重要的意義。

1 DNA測(cè)序

通過對(duì)DNA序列的直接測(cè)序可以直接了解其內(nèi)部的SNP位點(diǎn)的多態(tài)性和與疾病的關(guān)系。其檢測(cè)效率可以達(dá)到100%。各種SNP分析技術(shù)檢測(cè)得到的結(jié)果最后都是由測(cè)序確定其突變類型和位置。對(duì)于一些比較小、外顯子相對(duì)較少的基因的SNP檢測(cè)可直接測(cè)序，但是由于測(cè)序檢測(cè) SNP的方法相對(duì)昂貴，所以不適用于臨床大樣本檢測(cè)。

2 基因芯片技術(shù)

該技術(shù)系指將大量探針分子固定于支持物上，與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過檢測(cè)每個(gè)探針分子的雜交信號(hào)強(qiáng)度獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。該技術(shù)可以將大量的探針同時(shí)固定于支持物上，一次性檢測(cè)成百上千的DNA分子。Liang等〔3〕利用基因芯片技術(shù)對(duì)24例妊娠糖尿病和24例正常妊娠對(duì)照者rs13266634，rs266729，rs3802177和 rs9300039的 SNP位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，并以DNA測(cè)序方法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示在妊娠糖尿病與正常妊娠者 SNP基因型的 rs3802177，rs13266634和rs266729顯著差異，確定了用于篩選妊娠糖尿病的候選基因。2007年以來有關(guān)T2DM易感基因的GWAS也是利用了基因芯片技術(shù)〔2〕。這種技術(shù)由于芯片制作復(fù)雜，信號(hào)檢測(cè)需專門設(shè)備，需要昂貴的費(fèi)用，但在基因表達(dá)譜分析、基因診斷、藥物篩選以及序列分析等領(lǐng)域已呈現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用前景。

3 變性高效液相色譜技術(shù)(DHPLC)

在部分變性的溫度條件下，通過雜合與純合二倍體在柱中保留時(shí)間的差異，檢測(cè)目的DNA變異。異源雙鏈DNA與同源雙鏈DNA的解鏈特性不同，在部分變性條件下，異源雙鏈因有錯(cuò)配區(qū)的存在而更易變性，在色譜柱中的保留時(shí)間短于同源雙鏈，故先被洗脫下來，在色譜圖中表現(xiàn)為雙峰或多峰的洗脫曲線。Liu等〔4〕在中國甘肅東鄉(xiāng)族人群中采用聚合酶鏈反應(yīng)-變性高效液相色譜技術(shù)(PCR-DHPLC)檢測(cè)出固醇調(diào)節(jié)元件蛋白1c(SREBP-1c)基因的 rs2297508和 rs11868035 SNP可能與T2DM相關(guān)，C等位基因可能是T2DM的危險(xiǎn)等位基因。Liu等〔5〕將DHPLC和測(cè)序的方法相結(jié)合，對(duì)115例健康受試者和107例T2DM患者視黃醇結(jié)合蛋白4(RBP4)基因兩個(gè)單核苷酸多態(tài)性rs17484721和rs36035572進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)RBP4基因與T2DM有關(guān)。DHPLC具有高通量檢測(cè)、自動(dòng)化程度高、靈敏度和特異性較高、檢測(cè)DNA片段和長(zhǎng)度變動(dòng)范圍廣、相對(duì)價(jià)廉等優(yōu)點(diǎn)。但由于不同類型純合子的滯留時(shí)間幾乎相同，因此不能檢測(cè)出純合突變。

4 基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜法(MALDI-TOF-MS)

原理是針對(duì)突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出含有突變位點(diǎn)的DNA片段，然后在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入SNP序列特異延伸引物，在位點(diǎn)上延伸一個(gè)或若干個(gè)堿基，然后將制備的樣品分析物與芯片基質(zhì)形成結(jié)晶，將該晶體放入質(zhì)譜儀中，當(dāng)用激光激發(fā)晶體時(shí)，發(fā)生一個(gè)能量轉(zhuǎn)移與解吸附過程，產(chǎn)生單電荷離子，在加速電場(chǎng)中獲得相同的動(dòng)能，在真空小管中飛行到檢測(cè)器，利用質(zhì)譜分析對(duì)質(zhì)量的靈敏度特別高，很容易將僅含有一個(gè)不同堿基的兩段基因序列區(qū)別開的特點(diǎn)，使用質(zhì)譜直接或間接檢測(cè)等位基因特異性延伸區(qū)的反應(yīng)產(chǎn)物，推導(dǎo)出SNP。MALDITOF-MS在SNP檢測(cè)中具有很大的靈活性，高度的準(zhǔn)確性，與多重PCR結(jié)合在大量樣本的高通量檢測(cè)中得到較廣的應(yīng)用〔6〕。Florez等〔7〕利用此方法驗(yàn)證了斯堪的納維亞人蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶N1(PTPN1)基因多態(tài)性與T2DM的關(guān)系。

5 TaqMan探針技術(shù)

TaqMan熒光探針是一種寡核苷酸探針，熒光基團(tuán)連接在探針的5'末端，而淬滅劑則在3'末端。PCR擴(kuò)增時(shí)一對(duì)引物與特異性的熒光探針同時(shí)加入，探針完整的情況下，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收;PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，報(bào)告熒光基團(tuán)與淬滅熒光基團(tuán)分離，使得熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)接收到熒光信號(hào)，每擴(kuò)增一條DNA鏈就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成的同步。如果探針與目標(biāo)序列中存在著錯(cuò)配堿基，就會(huì)減少探針與目標(biāo)序列結(jié)合的緊密程度以及酶切的活性，影響釋放熒光的強(qiáng)度，通過檢測(cè)反應(yīng)液中的熒光強(qiáng)度就可以確定SNPs分型。Semiz等〔8〕利用TaqMan探針技術(shù)對(duì)波斯尼亞和黑塞哥維那人的63例T2DM和79例正常對(duì)照者的N-乙酰轉(zhuǎn)移酶2基因(NAT2)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)NAT2基因變異與T2DM有關(guān)。Taq-Man探針技術(shù)在PCR過程中無需分離和洗脫，減少了PCR污染的可能性，操作簡(jiǎn)便、快捷，較適合少量位點(diǎn)大量樣本的分型項(xiàng)目。但因所設(shè)計(jì)的探針僅有一個(gè)堿基的差異，所以檢測(cè)結(jié)果存在一定的假陽性率。

6 連接酶檢測(cè)反應(yīng)(LDR)技術(shù)

在Taq DNA連接酶的作用下，當(dāng)SNP位點(diǎn)上下游兩條寡核苷酸探針與目的DNA序列完全互補(bǔ)，并且兩條探針之間沒有空隙時(shí)，連接酶通過催化磷酸二酯鍵將相鄰的兩根探針連接，從而發(fā)生反應(yīng)，否則反應(yīng)將不能進(jìn)行，根據(jù)探針的設(shè)計(jì)，不同的基因型會(huì)產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的產(chǎn)物，最后通過熒光掃描片段長(zhǎng)度，實(shí)現(xiàn)對(duì) SNPs位點(diǎn)的檢測(cè)。Shi等〔9〕在對(duì)中國人 177例T2DM和245例健康對(duì)照者的TRB3基因Q84R位點(diǎn)多態(tài)性研究中，應(yīng)用PCR/LDR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TRB3基因Q84R位點(diǎn)多態(tài)性與中國人T2DM的發(fā)生無關(guān)，但與中國人糖尿病和非糖尿病人群的空腹胰島素水平和胰島素抵抗相關(guān)。優(yōu)點(diǎn):靈敏度高，特異性強(qiáng)，結(jié)果峰圖直觀，相對(duì)成本比TaqMan技術(shù)低。缺點(diǎn):高通量應(yīng)用中探針合成成本過高。

7 量子點(diǎn)(QDs)熒光探針技術(shù)

QDs作為生物熒光探針，有其獨(dú)特的優(yōu)越性:水溶性且穩(wěn)定、熒光強(qiáng)、分辨率高，與DNA等生物大分子進(jìn)行耦聯(lián)，而且在同一激發(fā)光源下可以進(jìn)行多色標(biāo)記便于進(jìn)行高通量的生物檢測(cè)。有課題組〔10〕將解耦聯(lián)蛋白3基因與脂聯(lián)素基因的突變質(zhì)粒與未突變質(zhì)粒等體積混合，模擬基因組DNA，在同一體系內(nèi)進(jìn)行雙重等位基因特異性PCR反應(yīng)，并利用磁性納米顆粒純化PCR產(chǎn)物，再將PCR產(chǎn)物與紅綠雙色量子點(diǎn)標(biāo)記的寡核苷酸探針進(jìn)行雜交反應(yīng)，通過熒光信號(hào)的檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了同一體系內(nèi)兩種基因 SNP的檢測(cè)。Li等〔11〕用585 nm和650 nm發(fā)光CdTe QDS通過鏈霉親和素與生物素分別結(jié)合不同的DNA寡核苷酸序列，并與毛細(xì)管電泳法(CE)結(jié)合，成功同步檢測(cè)兩種基因的單堿基突變。QDS熒光探針技術(shù)可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)單堿基突變，是一種高靈敏度的、很有前途的SNP分析技術(shù)。

2006年以前，T2DM的遺傳學(xué)研究比較緩慢，從2007年開始，有關(guān)歐洲、亞洲、美洲等人群的T2DM易感基因多態(tài)性的GWAS結(jié)果的報(bào)道，使人們對(duì)T2DM遺傳學(xué)有了突破性的認(rèn)識(shí)。截至目前T2DM GWAS已達(dá)二十多項(xiàng)〔12〕。研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合大多數(shù)的遺傳變異僅能解釋不到10%的T2DM遺傳可能性〔13〕。Vioght等〔14〕研究也顯示已知的T2DM基因變異僅能解釋10%～15%的家系相對(duì)危險(xiǎn)度。這些變異體占T2DM總遺傳力的比例很小。可能是由于GWAS僅檢測(cè)到了等位基因頻率＞5%的變異，而現(xiàn)有的檢測(cè)方法難以檢測(cè)高效應(yīng)值、中效應(yīng)值低頻率、罕見的變異。在過去的十余年里，許多不同的基因分型技術(shù)被用于檢測(cè)T2DM易感基因SNP和其他常見的多態(tài)性變異。最新一代的SNP檢測(cè)方法是基于納米材料技術(shù)、各種熒光標(biāo)記和熒光探針、多重PCR等技術(shù)的結(jié)合和利用，以便于提高SNP檢測(cè)的精準(zhǔn)性和通量。隨著技術(shù)的進(jìn)步，SNP檢測(cè)方法不斷推陳出新，如何應(yīng)用高通量、低成本的技術(shù)來檢測(cè)T2DM易感基因的罕見變異，將成為開發(fā)新的預(yù)防和治療方法以及個(gè)性化醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)。

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