張 瀾，郭 軍

南京醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實驗教學(xué)中心，南京210029

中性鞘磷脂酶是神經(jīng)鞘磷脂水解酶家族的重要成員，區(qū)別于酸性和堿性鞘磷脂酶，生理條件 (pH7.4)是其激活的最適環(huán)境［1］。已識別中性鞘磷脂酶家族有3個成員分布于哺乳動物體內(nèi)，中性鞘磷脂酶-1主要定位于核基質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器;中性鞘磷脂酶-3主要分布于心肌、條紋肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體中［2］，而中性鞘磷脂酶-2廣泛存在于細(xì)胞質(zhì)膜的胞漿面［3］，通過水解神經(jīng)鞘磷脂調(diào)控胞內(nèi)第二信使神經(jīng)酰胺水平，參與細(xì)胞的應(yīng)激、生長、分化和凋亡過程的調(diào)控［2］。

中性鞘磷脂酶-2的結(jié)構(gòu)與定位

中性鞘磷脂酶-2由655個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量約71 000，它包括1個C端催化區(qū)、2個N端疏水區(qū)、1個由200氨基酸殘基組成的膠原樣結(jié)構(gòu)域和Mg2+結(jié)合位點。目前對其膠原樣結(jié)構(gòu)域的功能尚不清楚［4］。此外，C端和N端均有磷酸化位點，其磷酸化水平與中性鞘磷脂酶-2的生物學(xué)活性密切相關(guān)。

催化區(qū)包含1個P-環(huán) (P-loop-like domain，PLL區(qū)域)和1個與蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)構(gòu)域［2］。前者又稱沃克環(huán)路A循環(huán)結(jié)構(gòu)域，包含GxxGxGK［T/S］(G:甘氨酸;K:賴氨酸;T:蘇氨酸;S:絲氨酸殘基;X:任意氨基酸)序列。在中性鞘磷脂酶-2中，PLL區(qū)常位于兩個高度保守殘基天冬氨酸-428和賴氨酸-433附近，可在賴氨酸協(xié)同下使中性鞘磷脂酶-2與核苷酸結(jié)合。點突變研究顯示，PLL的突變體對Mg2+具有更強的親和力，揭示PLL區(qū)在催化過程中需要2價陽離子的協(xié)調(diào)作用［1］。中性鞘磷脂酶晶體結(jié)構(gòu)分析表明，PLL為結(jié)構(gòu)高度多變的區(qū)域，因此，PLL具有“瓶蓋”作用，開啟后，有助于底物與催化部位的結(jié)合。PLL在與底物識別的過程中，具有較高的選擇性，能誘導(dǎo)鞘磷脂或少數(shù)其他底物 (如酵母中的肌醇磷酸甘油脂)進(jìn)入活性區(qū)域。此外，PLL也能通過轉(zhuǎn)導(dǎo)陰離子鞘磷脂 (anionic phospholipids，APL)結(jié)合到催化區(qū)來調(diào)控催化活性［1］。

最初研究認(rèn)為N端疏水區(qū)是跨膜區(qū)域，而酶拓?fù)鋵W(xué)研究揭示其疏水區(qū)僅插入細(xì)胞膜。同時，突變研究揭示兩個疏水端N端能發(fā)生棕櫚?；?(棕櫚酰化只發(fā)生在質(zhì)膜胞漿面)，證實其N端疏水區(qū)并非跨膜結(jié)構(gòu)［2］。中性鞘磷脂酶-2的棕櫚?；瘜ζ浞€(wěn)定及質(zhì)膜定位均有重要作用。在特定的刺激下 ［如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、H2O2］，中性鞘磷脂酶-2膜轉(zhuǎn)位增加，提示其高爾基體輸出對膜功能調(diào)節(jié)有重要作用［2］。

中性鞘磷脂酶-2水解神經(jīng)鞘磷脂的分子調(diào)控機(jī)制

中性鞘磷脂酶家族酶活性依賴于中性pH和陽離子環(huán)境［5］。中性鞘磷脂酶-2作為一種磷蛋白［6］，其活性受磷酸化、脂質(zhì)結(jié)合及信號蛋白結(jié)合等多種途徑調(diào)控。已證實Mg2+、Mn2+等陽離子在調(diào)節(jié)中性鞘磷脂酶-2活性發(fā)揮重要作用。同時，研究顯示Ca2+通過使磷脂酶A2和神經(jīng)酰胺激酶在細(xì)胞間積聚的增多，誘導(dǎo)中性鞘磷脂酶-2水解生成更多的神經(jīng)酰胺。且當(dāng)鈣離子濃度在0.1～1.0 μmol/L時誘導(dǎo)中性鞘磷脂酶-2的過度表達(dá)，并呈現(xiàn)出兩個鈣離子依賴性的表達(dá)高峰(10-7～10-6mol/L 和 10-3mol/L)［7］，其精確調(diào)控機(jī)制尚不清楚。

過氧化氫、煙草煙霧等氧化應(yīng)激能通過激活上游調(diào)控介質(zhì)p38絲裂原活化蛋白激酶和蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)誘導(dǎo)中性鞘磷脂酶-2磷酸化繼而上調(diào)其活性［6］。中性鞘磷脂酶-2存在5個特定的磷酸化位點，其中，絲氨酸-173、絲氨酸-208位于CaN結(jié)合位點附近，而絲氨酸-289、絲氨酸-292和絲氨酸-299則聚集在催化區(qū)域之前。絲氨酸-173、絲氨酸-289、絲氨酸-292和絲氨酸-299被證實與中性鞘磷脂酶-2的激活有關(guān)，而絲氨酸-208則與穩(wěn)定性相關(guān)。5個磷酸化位點間存在相互正性或負(fù)性調(diào)控的現(xiàn)象［8］。鈣調(diào)磷蛋白磷酸酶作為一種Ca2+/鈣調(diào)素依賴性的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，被證實與中性鞘磷脂酶-2的去磷酸化密切相關(guān)。首先，激活的鈣調(diào)磷蛋白磷酸酶能通過其PXLXIT序列與中性鞘磷脂酶-2的PQIKIY序列相結(jié)合，直接誘導(dǎo)中性鞘磷脂酶-2去磷酸化而抑制其活性。其次，H2O2通過氧化的二硫鍵修飾絲氨酸-173/208殘基從而抑制鈣調(diào)磷蛋白磷酸酶與中性鞘磷脂酶-2的相互作用，繼而上調(diào)中性鞘磷脂酶-2磷酸化水平及其活性［6］。

磷酸化作用不僅參與中性鞘磷脂酶-2的活性調(diào)控，還被認(rèn)為與中性鞘磷脂酶-2的表達(dá)增強有關(guān)。在人類乳腺癌細(xì)胞中，全反式維甲酸能激活PKCδ，引起啟動子Sp1區(qū)域的磷酸化，通過重建染色質(zhì)構(gòu)象而加速其轉(zhuǎn)錄，上調(diào)中性鞘磷脂酶-2的mRNA水平，繼而引起中性鞘磷脂酶-2及其下游產(chǎn)物神經(jīng)酰胺含量的升高。而全反式維甲酸抑制劑卡馬拉素能拮抗其誘導(dǎo)的中性鞘磷脂酶-2的mRNA水平升高，進(jìn)一步驗證上述結(jié)論［9］。此外，PKC家族的 PKCδ和 PKCζ也被識別參與了中性鞘磷脂酶-2活性和神經(jīng)酰胺水平的調(diào)控［10］。

脂質(zhì)結(jié)合是調(diào)控中性鞘磷脂酶-2細(xì)胞定位的另一重要機(jī)制。在體外，中性鞘磷脂酶-2能被多種APL以劑量依賴的形式激活，尤其是磷脂酰絲氨酸［1］。脂質(zhì)-蛋白覆蓋分析顯示:在體內(nèi)中性鞘磷脂酶-2能被磷脂酰絲氨酸和磷脂酸等代表性APL直接激活。突變研究表明中性鞘磷脂酶-2 N端存在兩個相互獨立的APL結(jié)合位點:氨基末端初始疏水區(qū)和精氨酸-33/45/48、氨基末端第二疏水區(qū)和精氨酸-92/93，其中任何1個或2個結(jié)合位點的突變都會引起APL結(jié)合抑制，繼而引起APL依賴的中性鞘磷脂酶-2催化活性下調(diào)。特別是兩個結(jié)合位點的共突變甚至?xí)鹬行郧柿字?2質(zhì)膜定位減少。疏水端苯丙氨酸和亮氨酸殘基與其后續(xù)的多個堿性氨基酸序列在中性鞘磷脂酶家族中高度保守，并在中性鞘磷脂酶-2與APL相互作用中發(fā)揮重要調(diào)控作用。同時，C端陽離子氨基酸在磷脂酰絲氨酸和磷脂酸誘導(dǎo)的中性鞘磷脂酶-2激活過程中發(fā)揮協(xié)同作用［11］。

蛋白與蛋白的相互結(jié)合是中性鞘磷脂酶-2活性調(diào)控的重要機(jī)制［1］。中性鞘磷脂酶-2具有潛在的蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其重復(fù)色氨酸-天冬氨酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域在中性鞘磷脂酶-2活性調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在TNF誘導(dǎo)中性鞘磷脂酶-2激活過程中，中性鞘磷脂酶激活相關(guān)因子，能通過其色氨酸-天冬氨酸串聯(lián)序列特異性結(jié)合TNF受體中性鞘磷脂酶激活結(jié)構(gòu)域和受體活化的蛋白激酶C(receptor activated protein kinase C，RACK)1的色氨酸-天冬氨酸結(jié)構(gòu)域，將中性鞘磷脂酶激活相關(guān)因子-RACK1復(fù)合體募集到細(xì)胞膜。同時TNFα能刺激蛋白質(zhì)胚胎外胚層發(fā)展蛋白 (embryonic ectodermal development，EED)(多梳蛋白家族中核內(nèi)色氨酸-天冬氨酸重復(fù)蛋白)由胞核輸出，并向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位，與RACK1和中性鞘磷脂酶-2催化區(qū)C端相結(jié)合，從而形成中性鞘磷脂酶激活結(jié)構(gòu)域/中性鞘磷脂酶激活相關(guān)因子/RACK1/EED/中性鞘磷脂酶-2膜內(nèi)復(fù)合體，誘導(dǎo)中性鞘磷脂酶-2激活和神經(jīng)酰胺的胞膜積累，其結(jié)合機(jī)制可能與整聯(lián)蛋白信號通路有關(guān)［12］。其中，對EED的抑制能直接阻止TNF活化中性鞘磷脂酶-2的過程，表明EED作為中性鞘磷脂酶-2和RACK1的銜接蛋白調(diào)控其活性［1］。

中性鞘磷脂酶-2的功能

中性鞘磷脂酶-2與細(xì)胞凋亡 細(xì)胞凋亡是機(jī)體維護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而由基因調(diào)控的程序性死亡。在細(xì)胞因子、血清饑餓和熱刺激等不良因素作用下，中性鞘磷脂酶-2能被顯著激活，觸發(fā)細(xì)胞程序性死亡［10］。在人乳腺癌細(xì)胞-7細(xì)胞中，中性鞘磷脂酶-2的激活可引起胞內(nèi)線粒體結(jié)構(gòu)改變、細(xì)胞色素C釋放以及半胱天冬酶-9的激活。通過對鼠肝臟細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn):中性鞘磷脂酶-2是凋亡通路中溶酶體透化作用的上游調(diào)節(jié)物質(zhì)，能使組織蛋白酶B釋放到胞質(zhì)溶膠［13］。中性鞘磷脂酶-2也能與其他信號分子協(xié)同完成對細(xì)胞凋亡的程序性調(diào)控［10］。

中性鞘磷脂酶-2與細(xì)胞生長抑制 在生長抑制的人乳腺癌細(xì)胞-7中可檢測到中性鞘磷脂酶-2 mRNA水平的上調(diào)，提示中性鞘磷脂酶-2與細(xì)胞生長抑制有關(guān)［10］。進(jìn)一步研究表明，下調(diào)中性鞘磷脂酶-2水平能同時抑制Rb蛋白磷酸化與p21WAF1的激活過程，使細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。同時，中性鞘磷脂酶-2可與多個細(xì)胞周期調(diào)控因子密切聯(lián)系，抑制細(xì)胞生長［2］。脂質(zhì)調(diào)節(jié)蛋白磷酸酶磷蛋白磷酸酶1被證實能作為中性鞘磷脂酶-2的下游調(diào)節(jié)物質(zhì)，調(diào)節(jié)細(xì)胞融合過程的細(xì)胞運動［14］。全反式維甲酸作為引起細(xì)胞周期停滯在G0/G1期的重要物質(zhì)已被證實通過上調(diào)中性鞘磷脂酶-2的mRNA水平，引起中性鞘磷脂酶-2及其下游產(chǎn)物神經(jīng)酰胺含量的升高。中性鞘磷脂酶-2還與端粒酶的抑制反應(yīng)和柔紅霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞周期停滯有關(guān)［2，9］。此外，抗氧化劑輔酶Q能抑制血清剝奪刺激中性鞘磷脂酶-2的活化和神經(jīng)酰胺的積聚，在中性鞘磷脂酶-2抑制細(xì)胞生長中發(fā)揮拮抗作用［2］。在癌變細(xì)胞中，可檢測出中性鞘磷脂酶-2鞘磷脂磷酸二酯酶3基因的一系列突變，提示中性鞘磷脂酶-2在癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［2］。

中性鞘磷脂酶-2與炎癥反應(yīng) 中性鞘磷脂酶-2可被多種致炎因子激活，其中TNF-α是最常見的中性鞘磷脂酶-2激活劑。長期TNF-α刺激能引起人乳腺癌細(xì)胞-7細(xì)胞中性鞘磷脂酶-2的過度表達(dá)，而急性刺激會誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞 (A549)、臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 (HUVEC)和平滑肌細(xì)胞中性鞘磷脂酶-2活性上調(diào)［2］，中性鞘磷脂酶-2的炎癥激活與TNF受體1中性鞘磷脂酶激活相關(guān)因子RACK1復(fù)合體形成、EED調(diào)節(jié)、PKC和p38絲裂原活化蛋白激酶誘導(dǎo)的磷酸化密切相關(guān)［2，12］。中性鞘磷脂酶2還被作為重要介質(zhì)，參與TNF-α對胞膜N-甲基-D-天 (門)冬氨受體突觸可塑性的調(diào)節(jié)。在與年齡相關(guān)的炎癥反應(yīng)中，衰老小鼠體內(nèi)檢測到高水平的中性鞘磷脂酶-2，研究顯示衰老刺激的白細(xì)胞介素 (interleukin，IL)-1β水平上調(diào)而不是IL-1β受體Ⅰ、C-JUN氨基末端激酶、IL-1β受體相關(guān)激酶-1和轉(zhuǎn)化生長因子β激活性激酶-1的功能異常激活，是中性鞘磷脂酶-2表達(dá)增加的重要誘因。此外，過度表達(dá)的中性鞘磷脂酶-2也具有正反饋調(diào)節(jié)作用，能通過誘導(dǎo)C-JUN氨基末端激酶磷酸化激活和IL-1β受體相關(guān)激酶的遍在蛋白化作用提高IL-1β水平［2］。

中性鞘磷脂酶-2與阿爾茨海默病 阿爾茨海默病人腦內(nèi)檢測發(fā)現(xiàn)中性鞘磷脂酶-2的高表達(dá)提示中性鞘磷脂酶-2參與阿爾茨海默病發(fā)病調(diào)控［2］。研究表明β淀粉樣蛋白 (amyloid-b peptide，Aβ)能激活中性鞘磷脂酶-2，引起神經(jīng)酰胺積聚［15-16］，同時高水平的中性鞘磷脂酶-2可以加速Aβ在腦組織內(nèi)的沉積，引起疾病的進(jìn)一步惡化。中性鞘磷脂酶抑制劑GW4869能有效抑制Aβ對神經(jīng)元損傷效應(yīng)更進(jìn)一步驗證了中性鞘磷脂酶-2在阿爾茨海默病發(fā)病過程中發(fā)揮的作用。此外，Aβ在激活中性鞘磷脂酶同時，也伴隨酸性磷酸酯酶活性上調(diào)［2］，以及神經(jīng)酰胺積累成為Aβ誘發(fā)阿爾茨海默病重要機(jī)制。

中性鞘磷脂酶-2與骨骼生長發(fā)育 采用基因敲除小鼠研究顯示:中性鞘磷脂酶-2基因敲除小鼠與野生型小鼠相比，精神身體發(fā)育明顯遲緩，并伴隨長骨變短和關(guān)節(jié)畸形的畸變表型，提示中性鞘磷脂酶-2在生物體骨骼生成與發(fā)育中發(fā)揮重要作用;深入分析表明:敲除中性鞘磷脂酶-2的小鼠與野生型相比，生長激素水平明顯下降，血清中類胰島素生長因子水平也顯著降低，推測上述變化可能與細(xì)胞周期的延長和發(fā)育不良有關(guān)［2，17］。在骨形成和牙本質(zhì)形成不全小鼠模型 (fro/fro小鼠)的獨立研究中，小鼠均呈現(xiàn)出生時身形小、長骨和軟骨處多處骨折并伴有嚴(yán)重的骨質(zhì)破壞但軟骨生長正常的表型，其原因可能與中性鞘磷脂酶-2上鞘磷脂磷酸二酯酶3基因的突變有關(guān)［2］。

綜上，基因敲除技術(shù)為中性鞘磷脂酶-2的研究帶來諸多突破，使其功能不僅僅局限于水解鞘磷脂生成第二信使神經(jīng)酰胺的酶類，更被證實參與細(xì)胞凋亡、生長抑制、炎癥反應(yīng)等多種生理病理過程，并與阿爾茨海默病及骨骼的生長畸變密切相關(guān)。同時，研究顯示中性鞘磷脂酶-2通過激活外染色體中miRNA的分泌，參與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［18］，并被證實與肺癌的形成密切相關(guān)［19］。然而，對中性鞘磷脂酶-2晶體結(jié)構(gòu)認(rèn)識的不足，如膠原樣區(qū)域、PLL區(qū)域在中性鞘磷脂酶-2功能上發(fā)揮的作用，Mg2+結(jié)合位點的位置確定等，為其結(jié)構(gòu)功能的闡明提出了許多亟待解決的新問題。同時，對中性鞘磷脂酶-2調(diào)控機(jī)制的研究尚不夠深入，如Ca2+離子調(diào)控中性鞘磷脂酶-2水平的精確機(jī)制至今不明等。這些都使中性鞘磷脂酶-2研究多停留在理論層面，其臨床應(yīng)用相對有限。因而，精確識別其作用靶點，深入揭示其調(diào)控機(jī)制，才能為癌癥、阿爾茨海默病等多種高發(fā)疾病的治療提供新的途徑和方法。

［1］Clarke CJ，Wu BX，Hannun YA.The neutral sphingomyelinase family:Identifying biochemical connections［J］.Adv Enzyme Regul，2011，51(1):51-58.

［2］Wu BX，Clarke CJ，Hannun YA.Mammalian neutral sphingomyelinases:regulation and roles in cell signaling responses［J］.Neuromol Med，2010，12(4):320-330.

［3］Tani M，Hannun YA.Analysis of membrane topology of neutral sphingomyelinase 2 ［J］.FEBS Lett，2007，581(7):1323-1328.

［4］Hofmann K，Tomiuk S，Wolff G，et al.Cloning and characterization of the mammalian brain-specific，Mg2+-dependent neutral sphingomyelinase［J］.Proc NatlAcad Sci USA，2000，97(11):5895-5900.

［5］Marchesini N，Luberto C，Hannun YA.Biochemical properties of mammalian neutral sphingomyelinase 2 and its role in sphingolipid metabolism ［J］.J Biol Chem，2003，278(16):13775-13783.

［6］Filosto S，F(xiàn)ry W，Knowlton AA，et al.Neutral sphingomyelinase 2(N-SMase2)is a phosphoprotein regulated by calcineurin(PP2B)［J］.J Biol Chem，2010，285(14):10213-10222.

［7］Kim SK，Ahn KH，Jeon HJ，et al.Purification of neutral sphingomyelinase 2 from bovine brain and its calcium-dependent activation ［J］.J Neurochem，2010，112(4):1088-1097.

［8］Filosto S，Ashfaq M，Chung S，et al.Neutral sphingomyelinase 2 activity and protein stability are modulated by phosphorylation of five conserved serines［J］.J Biol Chem，2012，287(1):514-522.

［9］Ito H，Tanaka K，Haqiwara K，et al.Transcriptional regulation of neutral sphingomyelinase 2 in all-trans retinoic acidtreated human breast cancer cell line，MCF-7 ［J］.J Biol Chem，2012，151(6):599-610.

［10］Clarke CJ，Hannun YA.Neutral sphingomyelinases and NSMase 2:bridging the gaps ［J］.Biochim Biophys Acta，2006，1758(12):1893-1901.

［11］Wu BX，Clarke CJ，Matmati N，et al.Identification of novel anionic phospholipid binding domains inneutral sphingomyelinase 2 with selective binding preference ［J］.J Biol Chem，2011，286(25):22362-22371.

［12］Philipp S，Puchert M，Adam-Klaqes S，et al.The Polycomb group protein EED couples TNF receptor 1 to neutral sphingomyelinase［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2010，107(3):1112-1117.

［13］Werneburg N，Guicciardi ME，Yin XM，et al.TNF-α-mediated lysosomal permeabilization is FAN and caspase 8/Bid dependent［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2004，287(2):G436-G443.

［14］Norma M，Jeffrey AJ，Yusuf AH.Confluence induced threonine41/serine45 phospho-β-catenin dephosphorylation via ce-ramide-mediated activation of PP1cγ ［J］.Biochim Biophys Acta，2007，1771(12):1418-1428.

［15］Jana A，Pahan K.Fibrillar amyloid-beta peptides kill human primary neurons via NADPH oxidase-mediated activation of neutral sphingomyelinase.Implications for Alzheimer’s disease［J］.J Biol Chem，2004，279(49):51451-51459.

［16］Jana A，Pahan K.Oxidative stress kills human primary oligodendrocytes via neutral sphingomyelinase:implications for multiple sclerosis［J］.J Neuroimmune Pharm，2007，2(2):184-193.

［17］Stoffel W，Jenke B，Block B，et al.Neutral sphingomyelinase 2(smpd3)in the control of postnatal growth and development［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102(12):4554-4559.

［18］Nobuyoshi K，Haruhisa L，Keitaro H，et al.Neutral sphingomyelinase 2(nsmase2)-dependent exosomal transfer of angiogenic microRNAs regulate cancer cell metastasis ［J］.J Biol Chem，2013，299(15):10849-10859.

［19］Goldkorn T，Chung S，F(xiàn)ilosto S.Lung cancer and lung injury:the dual role of ceramide［M］.Spei in Dis:Springer Vienna，2013:93-113.