米蕊芳，劉福生，金貴善

1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院北京市神經(jīng)外科研究所腦腫瘤研究中心，北京100050

2中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所病理學(xué)系，北京100005

瘤細(xì)胞中常見多倍體及瘤巨細(xì)胞的現(xiàn)象，并且與疾病的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，如乳腺癌［1］和黑色素瘤［2］等，其中的原因之一是細(xì)胞融合所引起的［3］。細(xì)胞融合也是細(xì)胞學(xué)及腫瘤領(lǐng)域的重要研究手段。在腫瘤惡性度研究方面，多種腫瘤細(xì)胞包括黑色素瘤細(xì)胞與正常的成纖維細(xì)胞融合后會出現(xiàn)瘤細(xì)胞惡性度降低的現(xiàn)象［4］;在腫瘤器官特異性轉(zhuǎn)移研究方面，特異性轉(zhuǎn)移到肺臟的瘤細(xì)胞以及特異性轉(zhuǎn)移到骨組織的瘤細(xì)胞融合后會特異轉(zhuǎn)移到肺組織和骨組織等［5］。聚乙二醇化學(xué)融合方法是傳統(tǒng)的細(xì)胞融合方法，但對于腫瘤細(xì)胞融合，其融合效率低，且并不適用于所有的腫瘤細(xì)胞融合。細(xì)胞電融合技術(shù)是近年發(fā)展的細(xì)胞融合技術(shù)，BTX ECM830電融合/電轉(zhuǎn)儀是實驗室常見儀器，多用于細(xì)胞轉(zhuǎn)化，也可用于細(xì)胞融合，但融合效率較差。細(xì)胞融合的前提是兩細(xì)胞膜的緊密接觸。植物血凝素 (phytohemagglutinin，PHA)是一種有絲分裂原，可以起到細(xì)胞凝聚的作用，使得兩細(xì)胞膜緊密接觸。本研究以黑色素瘤細(xì)胞為模型，結(jié)合PHA的細(xì)胞凝聚作用以及ECM830電融合作用，提高細(xì)胞融合效率，得到黑色素瘤溶瘤細(xì)胞，并進(jìn)一步探討融合細(xì)胞相應(yīng)特征。

材料和方法

細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16-F10、黑色素融合細(xì)胞B16/B16均培養(yǎng)于含5%胎牛血清并加青鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)液中。培養(yǎng)溫箱環(huán)境為5%CO2、37℃。

細(xì)胞標(biāo)記 分別用綠色熒光病毒pLL3.7和紅色熒光病毒pLL3.7-dsRED感染標(biāo)記B10-F10細(xì)胞 (感染過程中病毒數(shù)與細(xì)胞數(shù)之比，即感染復(fù)數(shù)=1)。pLL3.7質(zhì)粒以及相應(yīng)的包裝質(zhì)粒 pMDL，pREV和pVSVG購買于Addgene公司。pLL3.7-dsRED載體的構(gòu)建是將PCR所得的dsRED片段取代pLL3.7中的GFP片段而完成的。慢病毒用239T細(xì)胞包裝產(chǎn)生，其包裝和感染過程嚴(yán)格按參考文獻(xiàn) ［6］方法進(jìn)行。

ECM830化學(xué)細(xì)胞融合法 B16-F10-GFP(1×107)和B16-F10-RFP(1×107)混合離心后，用200 μl電擊液重懸，加入到電擊杯中，ECM830電融合儀 (美國BTX公司)250V，30 μs電擊3次，靜置5 min后將細(xì)胞植入到培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。

PHA-ECM830細(xì)胞融合法 混合B16-F10-GFP(1×107)細(xì)胞和B16-F10-RFP(1×107)細(xì)胞，DMEM液洗兩次，加入500 μl 50 mg/L的PHA(Sigma-Aldrich公司)液，37℃孵育30 min。孵育后的混合細(xì)胞900 r/min離心5 min。將離心后的上清液完全棄去，加入200 μl電擊液，用手頓挫振蕩開細(xì)胞，并移入到電擊杯中。ECM830電融合儀250V、30 μs電擊3次。靜置5 min后將細(xì)胞植入到培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。

熒光激活細(xì)胞分選 單色和雙色熒光標(biāo)記的細(xì)胞通過BDFACSAria流式分選儀 (BD公司)分選。分選后的細(xì)胞用含20% 胎牛血清和含兩倍雙抗的DMEM液收集。收集后立即培養(yǎng)于正常培養(yǎng)液中。

DNA含量測定 應(yīng)用碘化亞啶染色法測定DNA含量。將細(xì)胞按約80%的密度接種于60 mm培養(yǎng)皿中，次日收集細(xì)胞，PBS洗2次，75%乙醇固定過夜。將固定后的細(xì)胞PBS洗兩次，1 g/L核糖核酸酶 (Sigma-Aldrich公司)37℃消化30 min，0.5 g/L碘化亞啶 (Sigma-Aldrich公司)避光染色40 min，流式檢測DNA含量。

體外細(xì)胞增殖實驗 3×105細(xì)胞接種于60 mm培養(yǎng)皿中，每2天更換培養(yǎng)液，每天計數(shù)細(xì)胞數(shù)。

皮下成瘤實驗 胰酶消化細(xì)胞，PBS洗兩次，用PBS液將細(xì)胞懸起 (5×105/ml)，5×104個細(xì)胞皮下注射到C57BL/6小鼠 (北京維通利華實驗動物有限公司)腋下，用游標(biāo)卡尺每5天測量1次腫瘤體積。

統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P值用Excel軟件中的T檢驗計算。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

熒光標(biāo)記黑色素瘤融合細(xì)胞 B16-F10黑色素瘤細(xì)胞增殖速度快，惡性度高。將黑色素瘤細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記，并通過流式分選，得到了分別帶有綠色 (圖1A)和紅色熒光 (圖1B)標(biāo)記的黑色素瘤細(xì)胞亞克隆。

PHA-ECM830細(xì)胞融合法融合黑色素瘤細(xì)胞 首先用ECM830直接進(jìn)行黑色素瘤細(xì)胞融合，融合后的細(xì)胞種植于平皿中24 h后觀察可見:1個視野下很難見到黑色素瘤融合細(xì)胞，1個平皿中只有幾個黑色素瘤融合細(xì)胞，細(xì)胞融合效率低 (不到0.50%)。在此基礎(chǔ)上，在進(jìn)行ECM830電融合前加入PHA，使得兩細(xì)胞膜緊密接觸，熒光顯微鏡下可見到綠色熒光和紅色熒光黑色素瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜緊密接觸 (圖2A)。融合后取少許細(xì)胞展片，可見到帶有雙色熒光標(biāo)記的黑色素瘤融合細(xì)胞 (既帶有綠色熒光又帶有紅色熒光，疊加后呈現(xiàn)黃色)(圖2B)。

流式分選黑色素瘤融合細(xì)胞 融合細(xì)胞48 h后流式分析顯示帶有雙色熒光標(biāo)記的融合細(xì)胞所占的比例為7.18%，細(xì)胞融合效率較ECM830電融合法 (融合效率小于0.50%)提高約15倍。流式分選出帶有雙色熒光標(biāo)記的融合細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)后得到黑色素瘤融合細(xì)胞 (圖3)。

圖1 綠色 (A)及紅色 (B)熒光蛋白標(biāo)記黑色素瘤細(xì)胞 (×200)Fig 1 Labeled melanoma cells with GFP(A)and RFP(B)(×200)

圖2 黑色素瘤細(xì)胞經(jīng)PHA作用后電融合生成黑色素瘤融合細(xì)胞Fig 2 Melanoma fusion cells were obtained through the electrofusion method after treated with PHA

黑色素瘤融合細(xì)胞DNA含量的變化 DNA含量分析顯示，流式分選后的黑色素瘤融合細(xì)胞其DNA含量發(fā)生了翻倍的變化，由多二倍體轉(zhuǎn)化為多四倍體(圖4)。

黑色素瘤融合細(xì)胞增殖速度的變化 在細(xì)胞培養(yǎng)中，發(fā)現(xiàn)黑色素瘤融合細(xì)胞的傳代間隔時間明顯延長。進(jìn)一步體外增殖實驗表明融合細(xì)胞的增殖速度較融合前的黑色素瘤細(xì)胞明顯減慢 (圖5A)。皮下成瘤實驗表明黑色素瘤融合細(xì)胞的皮下腫瘤生長速度減慢(圖5B)。

圖3 流式分析及分選黑色素瘤融合細(xì)胞Fig 3 Melanoma fusion cells were analyzed and selected through fluorescence activated cell sorting

圖4 黑色素瘤融合細(xì)胞及黑色素瘤細(xì)胞的DNA含量Fig 4 DNA content of the melanoma fusion cells and melanoma cells

圖5 黑色素瘤融合細(xì)胞的體外增殖曲線及體內(nèi)生長曲線Fig 5 The melanoma fusion cells’proliferation curve in vitro and their growth curve in vivo

討 論

細(xì)胞融合在生物發(fā)育、組織修復(fù)和更新生成中均發(fā)揮重要作用，如精子細(xì)胞與卵子細(xì)胞融合形成受精卵、破骨細(xì)胞融合形成巨細(xì)胞、滋養(yǎng)細(xì)胞融合形成胎盤等［7］。細(xì)胞融合的異常和失調(diào)會導(dǎo)致疾病的發(fā)生，最常見的就是腫瘤。另一方面，細(xì)胞融合作為全基因組的有效研究手段在近年被廣泛應(yīng)用，特別是在腫瘤研究中針對腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移機(jī)制，就有巨噬細(xì)胞-腫瘤細(xì)胞融合理論等［8］。細(xì)胞融合及細(xì)胞融合技術(shù)是腫瘤的重要特征及研究方式。

細(xì)胞融合方法包括聚乙二醇化學(xué)融合法、ECM830電融合及ECM2001電融合技術(shù)。聚乙二醇化學(xué)融合法及ECM830電融合法均存在融合效率低的問題;而ECM2001電融合儀，雖然融合效率高，但對實驗室儀器以及實驗室平臺均有較高要求，限制了它的廣泛應(yīng)用。本研究結(jié)合PHA可使兩個腫瘤細(xì)胞緊密接觸的特征，在PHA作用的基礎(chǔ)上進(jìn)行電擊融合，從而大大提高細(xì)胞融合效率。ECM830是BTX公司較早推出的產(chǎn)品，在實驗室廣泛存在;PHA具有凝集各種細(xì)胞的作用，作用范圍廣，因而PHA-ECM830細(xì)胞融合方法是一種應(yīng)用廣泛且高效率的細(xì)胞融合方法。

本研究顯示黑色素瘤融合細(xì)胞的增殖速度減慢。增殖速度是腫瘤細(xì)胞惡性度的重要特征。有報道表明，腫瘤細(xì)胞尤其是黑色素瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞如成纖維細(xì)胞融合后會出現(xiàn)增殖速度降低的現(xiàn)象［9］，其可能的原因是正常細(xì)胞中的抑癌基因，如p53等發(fā)揮的作用。黑色素瘤融合細(xì)胞增殖速度減慢的具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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