譚振鵬 夏英杰 王柳萍 辛 寧

廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001

自從2000年8月國(guó)家藥品監(jiān)督管理局頒布《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求 (暫行)》之來(lái)，中藥指紋圖譜的研究工作已成為業(yè)內(nèi)的一個(gè)熱點(diǎn)，用于中藥材及中成藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定。指紋圖譜具有整體、宏觀和模糊分析的特點(diǎn)，特別適合于中醫(yī)藥傳統(tǒng)理論的研究需要，是目前能夠被國(guó)內(nèi)外廣泛接受的一種中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)模式［1］。但其同樣存在一定的局限性，與藥理作用相關(guān)性并不明確，無(wú)法從指紋圖譜中解析某一峰或者某一段峰所代表的藥理作用。因此，李戎等［2］提出在對(duì)方劑物質(zhì)群整體進(jìn)行控制的中藥指紋圖譜基礎(chǔ)上對(duì)應(yīng)藥效結(jié)果，建立起有實(shí)際意義的中藥“譜效”學(xué)，才能建立中藥產(chǎn)品與其療效基本一致的反映產(chǎn)品內(nèi)在質(zhì)量的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。目前，對(duì)于如何進(jìn)行譜效關(guān)系的研究尚無(wú)統(tǒng)一認(rèn)可的模式，本文主要對(duì)近年來(lái)眾學(xué)者在此方面進(jìn)行的研究文獻(xiàn)做簡(jiǎn)單的歸納、總結(jié)，為中藥譜效關(guān)系的進(jìn)一步研究做參考。

1 構(gòu)建譜效關(guān)系的基礎(chǔ)

1.1 指紋圖譜 中藥指紋圖譜是借用法醫(yī)學(xué)中的指紋圖譜這一概念，將中藥材或中成藥經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)奶幚碇?，運(yùn)用現(xiàn)代信息采集技術(shù)及質(zhì)量分析手段，獲得所測(cè)樣品的圖譜及數(shù)據(jù)信息，在對(duì)中藥成分系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上，構(gòu)建中藥指紋圖譜［3］。目前獲得中藥指紋圖譜的方法主要有光譜法和色譜法，比較常用的分析方法主要有薄層色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜、紅外光譜、色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)、毛細(xì)管電泳技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)等。目前，關(guān)于譜效關(guān)系研究的文獻(xiàn)中，使用的指紋圖譜主要集中在高效液相色譜法，氣相色譜法和色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)等方面。

1.1.1 高效液相色譜法 高效液相色譜法 (HPLC)有高效能、高準(zhǔn)確度、快速檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，配備不同的檢測(cè)器后，能滿足對(duì)不同性質(zhì)的樣品的測(cè)定，且穩(wěn)定性和重現(xiàn)性都較好。目前已有相當(dāng)數(shù)目文獻(xiàn)報(bào)道使用HPLC對(duì)中藥材和中成藥進(jìn)行指紋圖譜分析研究，其應(yīng)用范圍十分廣泛［4］。寧黎麗等［5］在吳茱萸湯原方基礎(chǔ)上按正交試驗(yàn)法組成9個(gè)不同配比的處方，對(duì)其進(jìn)行HPLC分析，并與以鎮(zhèn)痛和止嘔為指標(biāo)的藥理實(shí)驗(yàn)相關(guān)聯(lián)，確定吳茱萸湯的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。李友等［6］采用HPLC色譜峰獲得板藍(lán)根三氯甲烷部位的指紋圖譜，用于分析板藍(lán)根三氯甲烷提取部位抗內(nèi)毒素作用的譜效關(guān)系。林珊等［7］對(duì)太子參有效部位進(jìn)行HPLC指紋圖譜分析，并采用MTT法研究提取物對(duì)不同來(lái)源的腫瘤細(xì)胞株的作用。

1.1.2 氣相色譜法 氣相色譜法主要用來(lái)分析中藥材或中成藥中的揮發(fā)性成分，具有良好的分離效能和分離速度，封閉的色譜系統(tǒng)使其擁有較好的穩(wěn)定性，特別適用于含有揮發(fā)性成分的藥材和制劑指紋圖譜的研究［8］。尹蓮等［9］對(duì)加味四妙丸不同工藝全方及不同組合有效部位進(jìn)行藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)，測(cè)定其GC指紋圖譜，通過(guò)數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法將指紋圖譜共有峰相對(duì)面積與藥理數(shù)據(jù)二者關(guān)聯(lián)起來(lái)，比較GC指紋圖譜的有效共有峰的變化特征，得出其揮發(fā)油指紋圖譜中與藥效相關(guān)的色譜峰及揮發(fā)油成分在全方和有效部位群配伍組合后共有峰數(shù)量和峰面積的變化。研究表明指紋圖譜譜效關(guān)系是表征復(fù)方整體成分－配伍－藥效的相關(guān)性的有效途徑。

1.1.3 色質(zhì)聯(lián)用技術(shù) 色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)是指將色譜儀器與質(zhì)譜聯(lián)合使用的一種技術(shù)，在對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分離的基礎(chǔ)上，通過(guò)質(zhì)譜提供各指紋峰更多的信息，方便對(duì)指紋峰成分的鑒定。主要包括氣質(zhì)聯(lián)用 (GC－MS)和液質(zhì)聯(lián)用 (HPLCMS)。盧紅梅等［10］在對(duì)魚(yú)腥草注射液質(zhì)量控制的研究中采用GC－MS對(duì)不同廠家的注射液進(jìn)行分析，對(duì)有顯著藥效的第1類注射劑指紋圖譜進(jìn)一步定性分析，確定有效指紋峰族的主要成分。沈嵐等［11］采用HPLC－ESI－MS/MS分析芍藥甘草效應(yīng)組分給藥后的血清樣品，發(fā)現(xiàn)與藥效相關(guān)比較大的四個(gè)色譜峰的物質(zhì)為效應(yīng)組分代謝成分，直接獲得體內(nèi)活性物質(zhì)。宋玉超等［12］以川赤芍、赤芍、白芍不同提取物L(fēng)C－MS圖譜峰面積為基礎(chǔ)，對(duì) LC－MS圖譜和抑制細(xì)胞增殖的內(nèi)在聯(lián)系進(jìn)行譜效分析。

1.2 藥效學(xué)數(shù)據(jù) 藥效學(xué)數(shù)據(jù)可通過(guò)進(jìn)行科學(xué)合理的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)獲得。目前中藥藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究方法大致分為在體實(shí)驗(yàn)和離體實(shí)驗(yàn)。在體實(shí)驗(yàn)為了保持機(jī)體的完整性，通常使用正?；蛉斯?fù)制成疾病模型的動(dòng)物，并使機(jī)體與外界環(huán)境保持了正常聯(lián)系;離體實(shí)驗(yàn)則采用離體臟器，單一的考察藥物對(duì)機(jī)體某一部分的作用，較為直觀，細(xì)致的體外分析對(duì)于在細(xì)胞和亞細(xì)胞水平上進(jìn)行的機(jī)理研究有著重要的意義［13］。體外實(shí)驗(yàn)可以嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，所以具有重復(fù)性好，用藥量小、節(jié)省動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)結(jié)果較易分析等特點(diǎn);而在體實(shí)驗(yàn)保持了機(jī)體的完整性，適用于神經(jīng)反射、體液調(diào)節(jié)、內(nèi)臟功能、機(jī)體對(duì)藥物的代謝排泄等的觀察，而且可以選擇不同給藥途徑，更符合臨床實(shí)際［14］。賀福元等［15］認(rèn)為在中藥藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)過(guò)程中應(yīng)在機(jī)體藥物濃度為零時(shí)再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)后的效應(yīng)指標(biāo)觀察，比較藥物在機(jī)體血藥濃度均為零時(shí)的效應(yīng)指標(biāo)變化，分清效應(yīng)指標(biāo)的變化究竟是藥物產(chǎn)生的作用還是僅僅由于機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)造成。按照其實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法主要是研究效應(yīng)體對(duì)生物體的動(dòng)態(tài)作用，回答生物現(xiàn)象過(guò)程中的狀態(tài)函數(shù)的量變問(wèn)題，故建議首選在體實(shí)驗(yàn)。

對(duì)于構(gòu)建譜效關(guān)系的藥理實(shí)驗(yàn)應(yīng)當(dāng)根據(jù)研究課題的主要指導(dǎo)思想，建立符合中醫(yī)基礎(chǔ)理論的動(dòng)物模型，選取準(zhǔn)確、快速、公認(rèn)的方法和指標(biāo)來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。趙艷玲等［16］采用平板法測(cè)定不同來(lái)源板藍(lán)根正丁醇部位對(duì)大腸桿菌及金葡球菌的半數(shù)抑菌濃度，以此來(lái)作為衡量板藍(lán)根正丁醇部位的抑菌效果。王婭等［17］以角叉菜膠致大鼠足跖腫脹模型研究白虎湯及各配伍組的抗炎作用，測(cè)算腫脹抑制率作為指標(biāo)。李友等［6］用動(dòng)態(tài)濁度法檢測(cè)不同產(chǎn)地板藍(lán)根三氯甲烷萃取物抗內(nèi)毒素生物活性，得到板藍(lán)根對(duì)內(nèi)毒素抑制的量效關(guān)系曲線及其參數(shù)斜率(k)、半數(shù)有效劑量(IC50)。

2 構(gòu)建譜效關(guān)系的數(shù)據(jù)處理方法

指紋圖譜的測(cè)定和藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)的方法都處于比較成熟的階段，而如何將“譜”和“效”合理、科學(xué)的聯(lián)系起來(lái)還處在探索階段，沒(méi)有統(tǒng)一的可以遵循的模式，但根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道主要有以下幾種方法。

2.1 灰色關(guān)聯(lián)度分析 關(guān)聯(lián)度是事物之間、因素之間關(guān)聯(lián)性大小的度量。它定量的描述了事物或因素之間相互變化的情況，即變化的大小、方向與速度等的相關(guān)性。如果事物或因素發(fā)展的態(tài)勢(shì)基本一致，則可以認(rèn)為它們之間的關(guān)聯(lián)度較大，反之，關(guān)聯(lián)度較小。與其他的分析方法相比較，灰色關(guān)聯(lián)度分析所要求的數(shù)據(jù)較少，對(duì)數(shù)據(jù)的要求較低，原理簡(jiǎn)單，易于掌握和理解［18］。陳華國(guó)等［19］采用灰色關(guān)聯(lián)度分析虎杖不同極性提取物的HPLC指紋圖譜與其抗炎、抗腫瘤活性的相關(guān)性，研究證明二者有一定的相關(guān)性。朱詩(shī)塔等［20］用HPLC法研究掌葉大黃不同炮制品水提物指紋圖譜，用小鼠剪尾尖法研究其止血作用，用灰色關(guān)聯(lián)度分析方法研究其譜效關(guān)系。孟慶剛等［21］用灰色關(guān)聯(lián)統(tǒng)計(jì)方法將HPLC圖譜的各組分峰的峰面積和解熱藥效數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)，研究譜效相關(guān)性，找出黃芩解熱作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.2 聚類分析 聚類分析又稱群分析，是根據(jù)“物以類聚”的道理，對(duì)樣品或指標(biāo)進(jìn)行分類的一種多元統(tǒng)計(jì)分析方法，他們討論的對(duì)象是大量的樣品或數(shù)據(jù)，要求能合理按各自的特性來(lái)進(jìn)行合理的分類，沒(méi)有任何模式可供參考或依循，即是在沒(méi)有先驗(yàn)知識(shí)的情況下進(jìn)行的［22］。盧紅梅等［10］對(duì)各廠家的魚(yú)腥草注射劑指紋圖譜采用基于歐式距離和均連法的層級(jí)聚類分析方法進(jìn)行聚類，將六種不同廠家的產(chǎn)品分成兩類，再與藥效結(jié)果差異進(jìn)行比較，得出一類能夠體現(xiàn)抗炎藥效的魚(yú)腥草注射液指紋圖譜。趙艷玲等［16］為了研究中藥板藍(lán)根的正丁醇提取部位的化學(xué)指紋圖譜和抑菌活性，以系統(tǒng)聚類分析方法研究了不同來(lái)源樣品的化學(xué)成分差異性，結(jié)合抑菌活性做相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)板藍(lán)根正丁醇部位的抑菌活性有效成分。

2.3 相關(guān)分析 在中藥譜效關(guān)系學(xué)研究中，相關(guān)分析主要是指指紋圖譜中的“峰”與藥效學(xué)中的“效”之間的相互關(guān)系，由于譜效關(guān)系的復(fù)雜性，這種相互關(guān)系一般是非嚴(yán)格的、不確定的數(shù)量依存關(guān)系，稱之為相關(guān)關(guān)系，而相關(guān)分析的目的之一就是從這種不嚴(yán)格的關(guān)系中判斷其關(guān)系的密切程度［31］。沈嵐等［11］利用SPSS的雙變量相關(guān)分析方法處理所得各來(lái)源芍藥甘草的特征色譜峰與藥效抑制率的相關(guān)系數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)芍藥甘草效應(yīng)組分給藥后體內(nèi)4個(gè)色譜峰與藥效相關(guān)性較大，呈正相關(guān)。林立等［24］瀉白散中各藥進(jìn)行正交組合，測(cè)定HPLC指紋圖譜及評(píng)價(jià)祛痰、抗炎作用，采用雙變量相關(guān)分析法處理所得數(shù)據(jù)，得知桑白皮中有兩個(gè)峰顯示與祛痰抗炎作用有呈正相關(guān)，初步判斷為二苯乙烯苷類成分。黃勇等［25］用SPSS的雙變量相關(guān)分析法，分析來(lái)源于燈盞細(xì)辛提取物不同配伍組樣品的12個(gè)特征色譜峰與生物活性指標(biāo)的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)燈盞細(xì)辛在指紋圖譜中的B、C組分段具有明顯活性;其中4、7～12號(hào)色譜峰與活性呈現(xiàn)正相關(guān)。

2.4 回歸分析 回歸分析是研究一個(gè)或多個(gè)自變量與一個(gè)因變量之間，是否存在某種線性或是非線性的關(guān)系的一種分析方法。中藥譜效關(guān)系研究中多運(yùn)用多元線性回歸法，主要有強(qiáng)迫引入法、逐步回歸法、強(qiáng)迫剔除法、后向逐步法、前向逐步法。錢(qián)俊等［26］將加位四妙丸中各有效部位及各組方藥中的有效部位進(jìn)行正交組合，測(cè)定指紋圖譜及評(píng)價(jià)抗炎、鎮(zhèn)痛及降尿酸作用，用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件多元線性回歸分析中的強(qiáng)迫引入法和逐步回歸法處理所得數(shù)據(jù)，得出有效部位群中12個(gè)共有峰均與抗炎、鎮(zhèn)痛、將尿酸作用相關(guān)，并進(jìn)一步得出結(jié)果不同共有峰與不同藥效結(jié)果的相關(guān)性。許良等［27］對(duì)蒙藥森登－4湯進(jìn)行正交設(shè)計(jì)，拆方森登－4湯，將所得的16個(gè)組方一一做抗炎鎮(zhèn)痛藥理實(shí)驗(yàn)和反相高效液相進(jìn)行色譜分析，采用多元線性回歸法分析以上化學(xué)數(shù)據(jù)和生物數(shù)據(jù)，在32個(gè)色譜峰中有15個(gè)與藥理數(shù)據(jù)密切相關(guān)的色譜峰被引入回歸方程，說(shuō)明原方至少有15中成分在協(xié)同作用，成為抗炎鎮(zhèn)痛主要藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)

3 譜效關(guān)系研究思路

目前中藥譜效關(guān)系學(xué)主要應(yīng)用于單味藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)和中藥復(fù)方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)這兩方面。其根本的思路都是建立指紋圖譜，進(jìn)行藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)，然后通過(guò)數(shù)學(xué)軟件和計(jì)算機(jī)技術(shù)將二者聯(lián)系起來(lái)，即將“譜”與“效”聯(lián)系起來(lái)，建立更加合理全面的、符合中醫(yī)中藥理論體系的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系。

3.1 單味中藥材研究 對(duì)于單味中藥材，可以根據(jù)研究目的的不同，選取不同產(chǎn)地、不同品種、不同提取部位或是不同炮制方法的樣品建立指紋圖譜和進(jìn)行藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)，從而分析中藥材中哪些成分與藥效顯著相關(guān)，為進(jìn)一步建立評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量的指紋圖譜進(jìn)行指導(dǎo)。如趙艷玲等［16］選取10個(gè)不同來(lái)源的板藍(lán)根藥材進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分析了不用來(lái)源的樣品的化學(xué)成分的差異，結(jié)合抑菌活性做相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)板藍(lán)根正丁醇部位的抑菌活性有效成分。陳華國(guó)等［19］以虎杖不同提取部位的提取物為研究對(duì)象，進(jìn)行HPLC分析和抗菌、抗腫瘤實(shí)驗(yàn)。孟慶剛等［21］將黃芩提取物給予通過(guò)干酵母造大鼠發(fā)熱模型。將HPLC圖譜的各組分峰的峰面積和解熱藥效數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)，研究譜效相關(guān)性，找出黃芩解熱作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。

3.2 中藥復(fù)方研究 中藥復(fù)方成分比單味藥材更加復(fù)雜，為研究其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，通常將原方進(jìn)行拆方。用于拆方的思路和方法主要有單味藥研究法、撇藥分析法、分組研究法、據(jù)有效部位或成分的分組研究法和應(yīng)用數(shù)理原理指導(dǎo)拆方研究等［28］。實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)該根據(jù)實(shí)際需要，對(duì)不同拆方方法所得組別進(jìn)行指紋圖譜和藥效數(shù)據(jù)的采集，進(jìn)行譜效關(guān)系的分析。如寧黎麗等［5］通過(guò)對(duì)吳茱萸湯進(jìn)行組方藥量變化，在原方基礎(chǔ)上按正交試驗(yàn)法組成9個(gè)不同配比的處方。王婭等［17］對(duì)白虎湯及各配伍組共15個(gè)樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。錢(qián)俊等［26］將加位四妙丸中各有效部位及各組方藥中的有效部位進(jìn)行正交組合，得出8個(gè)樣品進(jìn)行試驗(yàn)。

4 總結(jié)

由于中醫(yī)藥理論與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的差異，中藥是我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的寶貴遺產(chǎn)，具有鮮明的民族特色，無(wú)論是它的指導(dǎo)思想還是它的用藥組成，都與西方藥物體系有著很大的區(qū)別。這也決定了現(xiàn)代中藥的研究，沒(méi)有一個(gè)現(xiàn)成的模版可以借鑒，必須走學(xué)科交叉與創(chuàng)新的道路［29］。中藥譜效關(guān)系將中藥指紋圖譜與中藥藥理學(xué)通過(guò)數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法結(jié)合起來(lái)，走了一個(gè)多學(xué)科交叉的路線，目前尚處于起步階段，有許多問(wèn)題需要解決。例如，相對(duì)于指紋圖譜構(gòu)建的眾多方法，用于譜效關(guān)系研究的指紋圖譜相對(duì)單一，如何將更多的指紋圖譜分析技術(shù)用于譜效關(guān)系研究也成為一個(gè)問(wèn)題。同時(shí)，李云飛等［30］提出將中藥多維指紋圖譜用于譜效關(guān)系研究也提供了一個(gè)新的思路;藥效學(xué)有效性的表述上大多采用的西醫(yī)的計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)，而未與中醫(yī)理論相結(jié)合;建立一個(gè)科學(xué)合理的數(shù)據(jù)處理方法系統(tǒng)，使其更加準(zhǔn)確的表達(dá)譜與效之間的關(guān)系。

中藥化學(xué)成分的多樣性與復(fù)雜性是發(fā)揮其療效的物質(zhì)基礎(chǔ)，同時(shí)也是質(zhì)量評(píng)價(jià)的重點(diǎn)與難點(diǎn)，在現(xiàn)有研究手段和條件下，由于中醫(yī)藥理論與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的差異，使得闡明中藥的有效成分是一項(xiàng)極為困難的研究課題。進(jìn)一步完善中藥譜效關(guān)系的研究有助于建立一種合理、有效的中藥內(nèi)在品質(zhì)的研究和評(píng)價(jià)方法，并填補(bǔ)中藥質(zhì)量控制指標(biāo)與藥效研究相脫節(jié)的空白，這對(duì)中藥的現(xiàn)代化和國(guó)際化有著重要的意義?？傊?，中藥譜效關(guān)系的研究將成為今后中藥研究的一個(gè)重點(diǎn)方向和有利手段，同樣也是一個(gè)研究難點(diǎn)，需要在不斷實(shí)踐中探索而完善。

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