胡紫霞，王漢清，王 立 ，殷冬冬，占松鶴 ，王楠楠，朱良強(qiáng)，王桂軍

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，安徽合肥 230036；2.安徽省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，安徽合肥 230031）

鴨坦布蘇病毒病是由鴨坦布蘇病毒（Duck tembusu virus，DTMUV）引起的蛋鴨和種鴨一種急性傳染病，病鴨以采食量和產(chǎn)蛋率急劇下降并伴有淘汰和死亡為特征[1-2]。該病自2010年首次在我國(guó)發(fā)現(xiàn)以來，目前在各蛋鴨場(chǎng)和種鴨場(chǎng)均有不同程度地發(fā)生，已成為危害養(yǎng)鴨業(yè)最嚴(yán)重的疾病之一。據(jù)調(diào)查，該病一旦發(fā)生流行，鴨群內(nèi)發(fā)病率幾乎為100%，產(chǎn)蛋率下降30%～60%，死淘率最高可達(dá)20%～30%，而且發(fā)病鴨群整體均勻度降低，抗病力下降，易繼發(fā)感染其它細(xì)菌性疾病，給養(yǎng)鴨業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3-6]。

鴨坦布蘇病毒病發(fā)病急，傳播迅速，目前尚無有效的疫苗可用，藥物治療效果也不理想，臨床上較難控制[7]。本研究以鴨坦布蘇病毒AH-F10株滅活免疫制劑多次免疫高產(chǎn)蛋雞，制備抗坦布蘇病毒高免卵黃抗體，經(jīng)臨床初步應(yīng)用，對(duì)鴨坦布蘇病毒病具有良好的預(yù)防和治療作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 鴨坦布蘇病毒AH-F10株由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物傳染病實(shí)驗(yàn)室分離鑒定，保存于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，編號(hào)CCTC V2012013；鴨坦布蘇病毒瓊擴(kuò)檢測(cè)抗原由本制備；SPF雞胚由本實(shí)驗(yàn)室孵化器孵化10日齡用于實(shí)驗(yàn)；高產(chǎn)蛋雞為合肥市某雞場(chǎng)飼養(yǎng)的130日齡健康羅曼商品代蛋雞，用于免疫接種鴨坦布蘇病毒免疫制劑，制備高免卵黃抗體；3周齡櫻桃谷商品代雛鴨購(gòu)自安徽某種鴨場(chǎng)，且種鴨坦布蘇病毒抗體陰性；瓊脂糖、氯仿、硫酸銨等為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 鴨坦布蘇病毒滅活免疫制劑的制備 取鴨坦布蘇病毒AH-F10株接種10日齡SPF雞胚增殖培養(yǎng)，收集接毒后84h左右死亡的雞胚尿囊液，經(jīng)甲醛滅活作為水相與白油及乳化劑按一定比例進(jìn)行乳化，制成油包水型乳劑滅活免疫制劑。經(jīng)無菌檢驗(yàn)和安全檢驗(yàn)合格后，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 免疫高產(chǎn)蛋雞 用上述制備的滅活免疫制劑免疫130日齡健康高產(chǎn)羅曼商品蛋雞60只，首次經(jīng)頸部皮下注射免疫，免疫劑量為0.8mL/只。分別間隔2周進(jìn)行第2次和第3次免疫，免疫劑量為1.5mL /只，免疫途徑相同。第3次免疫10d后進(jìn)行第4次免疫，免疫劑量為2mL/只，于頸部和胸部皮下多點(diǎn)注射。

1.4 卵黃抗體制備 在第4次免疫后1周開始收獲雞蛋，測(cè)定卵黃中的鴨坦布蘇病毒瓊擴(kuò)抗體效價(jià)。收集瓊擴(kuò)抗體效價(jià)達(dá)1∶32以上的雞蛋作為高免蛋制備卵黃抗體。將高免蛋用自來水清洗污物后浸泡于0.05%百毒殺10min，然后用紗布擦干后晾干。用75% 酒精棉球進(jìn)行蛋殼表面消毒，無菌操作打開蛋殼，分蛋清，將蛋黃倒入消毒玻璃燒杯內(nèi)備用。將卵黃和滅菌生理鹽水按1∶4的比例稀釋，在高速組織搗碎機(jī)中2000 r / min 勻漿5 min，加青霉素、鏈霉素各1000 U / mL，然后按0.01%加入硫柳汞，分裝于滅菌玻璃瓶中，加塞密封并標(biāo)記，置室溫立即進(jìn)行純化或置于-20℃冰箱備用[8-9]。

1.5 卵黃抗體純化 取上述粗制卵黃抗體，加入1倍體積的氯仿，充分振蕩后，4000r/min.離心20min.，收集上層水相，加入飽和硫酸銨使其終濃度為50%，4℃靜置1 h，5000r/min.離心20min.，棄上清，用與原卵黃抗體等體積的滅菌生理鹽水溶解沉淀，加入飽和硫酸銨，使其終濃度為30%，5000r/min.離心20min.，棄上清，用與原卵黃抗體體積相等的0.01mol/L的PBS（pH7.4）溶解沉淀，透析24h，在-20℃冰箱中保存?zhèn)溆肹10]。

1.6 純化卵黃抗體的無菌檢驗(yàn)、效價(jià)測(cè)定和安全檢驗(yàn) 在無菌條件下，分別取0.2mL上述純化的卵黃抗體接種鮮血瓊脂平板和厭氧肉湯平板中，37℃培養(yǎng)48h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況；采用瓊脂擴(kuò)散方法檢測(cè)純化卵黃抗體的瓊擴(kuò)效價(jià)；安全檢驗(yàn)，取健康雛鴨16只隨機(jī)分為2組，一組為試驗(yàn)組，腿部肌注純化的卵黃抗體1mL/只，另一組為對(duì)照組，腿部肌注生理鹽水1mL/只，連續(xù)觀察雛鴨狀況72h，72h后剖檢雛鴨，觀察心、肝、脾、腦等器官有無病理變化。

1.7 卵黃抗體對(duì)雛鴨的保護(hù)力檢驗(yàn) 將3周齡健康雛鴨30只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分成A、B和C 3個(gè)組，每組10只。A組鴨腿部肌注純化卵黃抗體0.5mL/只，B、C組作對(duì)照。24h后，將A和B組鴨分別經(jīng)腿部肌注AH-F10毒株0.5mL/只，C組鴨經(jīng)腿部肌注滅菌生理鹽水0.5mL/只。將3組雛鴨隔離飼養(yǎng)，連續(xù)觀察1周，觀察雛鴨發(fā)病和死亡情況。

1.8 卵黃抗體對(duì)成年鴨的治療試驗(yàn) 從某養(yǎng)鴨戶購(gòu)買186日齡健康產(chǎn)蛋麻鴨20只，人工感染AHF10毒株0.5mL/只，觀察感染鴨采食、飲水、產(chǎn)蛋和精神狀態(tài)，待出現(xiàn)精神不振、采食減少時(shí)，肌注上述純化卵黃抗體2mL/只，每日1次，連續(xù)注射3天。連續(xù)2周，觀察試驗(yàn)鴨的采食和產(chǎn)蛋量恢復(fù)狀況。

2 結(jié)果

2.1 卵黃抗體檢測(cè)結(jié)果 無菌條件下，純化卵黃抗體在鮮血瓊脂平板和厭氧肉湯平板37℃培養(yǎng)48h后，均無細(xì)菌生長(zhǎng)，菌檢均為陰性。采用瓊脂擴(kuò)散方法檢測(cè)純化卵黃抗體的瓊擴(kuò)效價(jià)達(dá)1∶32以上，純化卵黃抗體與抗原之間出現(xiàn)清晰致密的沉淀帶。安全檢驗(yàn)結(jié)果為：試驗(yàn)組和對(duì)照組雛鴨均未呈現(xiàn)異常癥狀，72h后對(duì)16只雛鴨進(jìn)行解剖，結(jié)果表明與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組雛鴨心、肝、脾、腦均未呈現(xiàn)任何病理變化，說明制備的卵黃抗體安全性良好。

2.2 卵黃抗體對(duì)雛鴨的保護(hù)力檢驗(yàn) 注射抗體后進(jìn)行AH-F10攻毒的A組有1只雛鴨在攻毒第2天出現(xiàn)減食和腹瀉癥狀，第5天恢復(fù)正常，觀察期內(nèi)未見死亡。觀察1周后捕殺，均無肉眼可見病變。沒有注射純化卵黃抗體的B組雛鴨，經(jīng)AH-F10毒株攻毒第3天均出現(xiàn)精神沉郁，減食，腹瀉、拉綠色稀糞，喜臥，并伴有輕度神經(jīng)性癥狀。觀察期內(nèi)死亡8只，解剖見腦膜、肝臟、胰腺出血，腸道腫大。對(duì)照組C組雛鴨一直保持良好精神狀態(tài)，試驗(yàn)期間均未見發(fā)病、死亡，1周后后捕殺均無肉眼可見病變。表明制備的卵黃抗體對(duì)抗雛鴨坦布蘇病毒病有良好的保護(hù)效果。

2.3 卵黃抗體對(duì)成年鴨坦布蘇病毒的治療效果 試驗(yàn)鴨從鴨場(chǎng)購(gòu)買回來隔離飼養(yǎng)，人工感染鴨坦布蘇病毒病后3天，部分試驗(yàn)鴨出現(xiàn)精神沉郁、采食量減少，所有鴨停止產(chǎn)蛋。應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室的制備純化的抗鴨坦布蘇病毒抗體緊急治療，注射后第2天采食量略有回升，精神狀態(tài)略有好轉(zhuǎn)。治療第4天，1周后鴨群的采食基本恢復(fù)正常，部分鴨開始產(chǎn)蛋。結(jié)果表明，應(yīng)用該卵黃抗體能有效控制產(chǎn)蛋鴨坦布蘇病毒病，對(duì)感染產(chǎn)蛋鴨的采食量和產(chǎn)蛋率的恢復(fù)有良好的治療效果。

3 小結(jié)和討論

3.1 卵黃抗體因其具有性質(zhì)穩(wěn)定、成本低、產(chǎn)量高的優(yōu)點(diǎn)，已廣泛用于生物及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，在家禽、家畜及人類疾病診斷與防治方面應(yīng)用廣泛，對(duì)病毒性疾病治療更是具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[11]。利用異源動(dòng)物制備高免卵黃抗體，具有動(dòng)物種系發(fā)生距離優(yōu)勢(shì)，更適于產(chǎn)生特異性抗體，具有良好開發(fā)前景。應(yīng)用卵黃抗體治療動(dòng)物傳染病方面研究已有不少報(bào)道[12，13]，尤其在預(yù)防和治療一些家禽急性傳染病如鴨病毒性肝炎、雞傳染性法氏囊病等發(fā)揮重要的作用[11，14]。

3.2 鴨坦布蘇病毒病是近年來在我國(guó)出現(xiàn)的鴨急性傳染病，目前自然發(fā)生該病主要引起種鴨和蛋鴨的產(chǎn)蛋下降。鴨坦布蘇病毒AH-F10株是本實(shí)驗(yàn)室從安徽發(fā)病鴨場(chǎng)分離到的，經(jīng)人工攻毒試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其對(duì)雛鴨也有較強(qiáng)的致病性，并引起雛鴨死亡。因此，本研究用雛鴨人工攻毒試驗(yàn)來觀察卵黃抗體對(duì)鴨坦布蘇病毒病的預(yù)防和治療作用。在當(dāng)前尚沒有有效的疫苗預(yù)防的情況下，采用卵黃抗體預(yù)防和控制鴨坦布蘇病毒有著積極意義。

3.3 對(duì)正處于高產(chǎn)的種鴨和蛋鴨一旦暴發(fā)鴨坦布蘇病毒病，產(chǎn)蛋率在短時(shí)間內(nèi)急劇下降，在沒有繼發(fā)感染情況下，一般2～4周流行自行結(jié)束，采食量和產(chǎn)蛋率逐步恢復(fù)。由于沒有特效藥物治療，不少養(yǎng)鴨場(chǎng)在發(fā)病期間使用利巴韋林、黃芪多糖、金剛烷胺等抗病毒藥物來治療鴨坦布蘇病毒病。從治療效果來看并不理想，而且發(fā)病期間使用抗病毒藥物的鴨場(chǎng)在流行結(jié)束后產(chǎn)蛋率的恢復(fù)更為緩慢，因而，應(yīng)用高免卵黃抗體對(duì)特異性地預(yù)防和治療鴨坦布蘇病毒病，對(duì)鴨群產(chǎn)蛋率的恢復(fù)有較好的促進(jìn)作用。

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