白艷菊

應(yīng)用核酸檢測(cè)(NAT)技術(shù)不僅能檢測(cè)出窗口期HBV、HCV、HIV感染,還可以避免病毒變異、免疫沉默性感染等造成的漏檢,在歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家早在上世紀(jì)90年代,核酸檢測(cè)(NAT)作為常規(guī)技術(shù)納入獻(xiàn)血者篩查[1]。2012版《血站技術(shù)操作規(guī)程》規(guī)定經(jīng)血傳播感染的檢測(cè)方法將HBV、HCV、HIV核酸檢測(cè)方法納入到常規(guī)模式當(dāng)中[2]。吉林市紅十字中心血站是第二批進(jìn)行核酸檢測(cè)的試點(diǎn)單位。自2012年4月17日開(kāi)始對(duì)無(wú)償獻(xiàn)血者的血液進(jìn)行HBV、HCV、HIV核酸檢測(cè)(NAT)現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源與處理 2012年4月17日至2012年11月27日留取本站無(wú)償獻(xiàn)血者經(jīng)兩遍ELISA檢測(cè)合格和單項(xiàng)陽(yáng)性待檢的22688份無(wú)償獻(xiàn)血者標(biāo)本,血液采集后留取5 ml血液置于NAT專用分離膠試管中,采集后4 h內(nèi)3000 r/min離心20 min,置于2～8℃冰箱保存。

1.2 儀器 上海科華核酸血篩系統(tǒng)：Hamilton Microlab STAR匯集提取儀；7500擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)儀；數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)；脫蓋離心機(jī)。 酶免檢測(cè)系統(tǒng)： STAR加樣器；FAME全自動(dòng)酶免分析儀；離心機(jī)；LisWell系統(tǒng)。

1.3 試劑 HBV、HCV、HIV核酸提取試劑和檢測(cè)試劑均為上海科華廠家提供。酶免試劑盒：抗-HCV(科華/新創(chuàng) )、HBsAg(科華 /新創(chuàng) )、抗 -HIV(萬(wàn)泰 /麗珠 )、抗 -TP(麗珠/科華)以上試劑都是經(jīng)國(guó)家批檢合格并在有效期內(nèi)使用。

1.4 ELISA法對(duì)酶免標(biāo)本進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)。用STAR加樣器加樣,用FAME全自動(dòng)酶免分析儀對(duì)HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、抗-TP進(jìn)行檢測(cè), 采用不同廠家試劑不同人員進(jìn)行兩次檢測(cè)。LisWell系統(tǒng)判讀。雙試劑初篩反應(yīng)性判為陽(yáng)性,單試劑初篩反應(yīng)性雙孔復(fù)檢反應(yīng)性判為陽(yáng)性,雙試劑非反應(yīng)性判為陰性。共有22688份ELISA檢測(cè)合格和待查標(biāo)本進(jìn)行核酸檢測(cè)。對(duì)核酸判為陽(yáng)性的標(biāo)本,再次從血袋取血重新檢測(cè)酶免。

1.5 核酸擴(kuò)增檢測(cè) 當(dāng)天進(jìn)行ELISA檢測(cè),第二天將ELISA檢測(cè)合格和待查標(biāo)本進(jìn)行核酸檢測(cè)。核酸標(biāo)本在脫蓋離心機(jī)3000 r/min離心20 min,在生物安全柜內(nèi)擺到標(biāo)本架上,用Hamilton Microlab STAR進(jìn)行全自動(dòng)8個(gè)標(biāo)本匯集到一個(gè)pooling里；之后進(jìn)行提?。患拥街修D(zhuǎn)板；再轉(zhuǎn)移到加了反應(yīng)液的反應(yīng)板；貼膜在7500擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行擴(kuò)增。檢測(cè)HBV、HCV和HIV3個(gè)項(xiàng)目。出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果的八混樣管,再次進(jìn)行單人份核酸檢測(cè),還是陽(yáng)性的標(biāo)本判為核酸檢測(cè)陽(yáng)性。

2 結(jié)果

在22688份核酸標(biāo)本中,共檢出6例ELISA法陰性、NAT陽(yáng)性標(biāo)本。其中有5例是HBV陽(yáng)性、一例是HIV陽(yáng)性。再留取相應(yīng)血袋血再檢結(jié)果相同。ELISA法篩查,漏檢率HBV是0.022% 、HIV是0.0044%。對(duì)ELISA法陰性,核酸檢測(cè)HIV陽(yáng)性的標(biāo)本的獻(xiàn)血者進(jìn)行了跟蹤驗(yàn)證,結(jié)果 2012年5月22日, 酶免結(jié)果 (S/CO值)0.00/0.04(試劑為珠海麗珠 /試劑為北京萬(wàn)泰)結(jié)果陰性 。核酸結(jié)果(CT值)匯集管結(jié)果：28.0 ； 單檢結(jié)果(CT值)25.1 核酸檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。2012年5月29 日,對(duì)此獻(xiàn)血者重新抽血,酶免結(jié)果 (S/CO值1.08/2.18(試劑為珠海麗珠/試劑為北京萬(wàn)泰) 酶免結(jié)果為弱陽(yáng)性 核酸單檢結(jié)果(CT值)：16.7 核酸檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性 將此樣本稀釋1000倍 核酸單檢結(jié)果(CT值)25.99。核酸檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。追蹤驗(yàn)證證明此獻(xiàn)血者為HIV窗口期。

3 討論

所謂“窗口期”是指從感染病原開(kāi)始直至用某種檢測(cè)方法能夠檢測(cè)到該病原存在的這一段時(shí)間,血清學(xué)抗原抗體檢測(cè)的“窗口期”較長(zhǎng)。在目前使用的ELISA檢測(cè)試劑的條件下,HBsAg、抗-HCV、抗-HIV的平均“窗口期”分別為56 d、82 d、22 d,而采用核酸檢測(cè)技術(shù)(NAT)HBV、HCV、HIV的平均“窗口期”可分別縮至25 d、59 d、11 d[3]。我國(guó)現(xiàn)在采用ELISA方法檢測(cè)HBsAg、抗-HCV、抗-HIV,吉林地區(qū)HBV漏檢率0.022%；HIV漏檢率0.0044%這說(shuō)明現(xiàn)有的ELISA檢測(cè)方法存在“窗口期”漏檢的危險(xiǎn),NAT技術(shù)可以縮短病毒窗口期,降低經(jīng)輸血傳播病毒的風(fēng)險(xiǎn)。在西方國(guó)家,有10萬(wàn)人,年因輸入“窗口期”血液導(dǎo)致的HBV、HCV、HIV感染分別達(dá)2.70(95%CI：0.32～9.77),2.41(95% CI：0.29-8.70)和 4.06(95% CI：0.82～11.85)萬(wàn)人 /年[4]。

本研究中,在2012年4月17日至2012年11月27日,篩查22688份ELISA法檢測(cè)陰性的標(biāo)本,用NAT檢測(cè)篩查出1例HIV陽(yáng)性和5例HBV陽(yáng)性標(biāo)本,ELISA檢測(cè)陰性標(biāo)本,HBV“窗口期”發(fā)生率0.022%,HIV“窗口期”發(fā)生率0.0044%,沒(méi)有檢測(cè)出HCV,說(shuō)明NAT能有效檢測(cè)出ELISA漏檢的病毒早期感染標(biāo)本。NAT方法經(jīng)過(guò)大量研究證實(shí),其靈敏度,精確度和準(zhǔn)確度已符合對(duì)ELISA“窗口期”標(biāo)本的檢出要求對(duì)病毒載量大于等于50 IU/ml HCV、HIV檢出陽(yáng)性率可達(dá)100%[5]。由此可見(jiàn)酶免試劑盒質(zhì)量在不斷提高,患者輸血后感染疾病的風(fēng)險(xiǎn)已經(jīng)很低,但由于我國(guó)是HBV感染率較高的地區(qū),ELISA“窗口期”漏檢是當(dāng)前影響血液安全性進(jìn)一步提高的瓶頸,單純抗原或抗體血清學(xué)檢測(cè)不能有效保證血液安全。ELISA方法篩查陰性的血液仍有漏檢的可能。對(duì)輸血安全造成隱患,因此為了進(jìn)一步提高血液的安全性,有必要在我國(guó)目前常規(guī)的ELISA的血液篩查中引進(jìn)NAT檢測(cè)來(lái)保證輸血安全。

[1] 任芙榮,核酸檢測(cè)技術(shù)在國(guó)內(nèi)外血液篩查中的應(yīng)用.北京醫(yī)學(xué),2008,40(8):561-564.

[2] 衛(wèi)醫(yī)政發(fā)[2012]1號(hào)附件.《血站技術(shù)操作規(guī)程》.

[3] 王迅,鄧嵐,張穎,等.核酸擴(kuò)增技術(shù)(NAT)在上海血液篩查中的初步應(yīng)用.中國(guó)輸血雜志,2003,16(3):157-160.

[4] 趙全壁,蔡淑霞,劉玉磊.新疆伊犁哈薩克地區(qū)無(wú)償獻(xiàn)血人群中HIV HBV和HCV的核酸檢測(cè).中國(guó)艾滋病性病。2010,16(6):539-606.

[5] 任芙蓉,劉長(zhǎng)利,呂秋霜,等.病毒核酸檢測(cè)在獻(xiàn)血者篩查中的應(yīng)用.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2004,27(9):596-599.