邱彩玲，呂文河，魏 琪，呂典秋，李學(xué)湛，白艷菊*

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物脫毒苗木研究所，黑龍江 哈爾濱 150086；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150030）

馬鈴薯，其經(jīng)濟(jì)價(jià)值在全世界的作物中占第四位。然而，諸多的病害卻威脅著馬鈴薯的生產(chǎn)，其中馬鈴薯紡錘塊莖類病毒（Potato spindle tuber viroid，PSTVd）就是其中重要的一種。PSTVd自1922年發(fā)現(xiàn)以來(lái)，已經(jīng)迅速地傳播到了許多國(guó)家，如加拿大、阿根廷、俄羅斯（前蘇聯(lián)）、波蘭、匈牙利和保加利亞等，后來(lái)又傳入中國(guó)，并已經(jīng)造成了一定的經(jīng)濟(jì)損失。

PSTVd具有高度的侵染性，是引起馬鈴薯品種退化和產(chǎn)量降低的主要病害之一。PSTVd強(qiáng)系可引起減產(chǎn)60%，弱系減產(chǎn)20%～35%，并且會(huì)使塊莖畸形，變小，降低馬鈴薯的產(chǎn)量和商品性，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。由于該病害危害重，易傳播，因此，中國(guó)及很多國(guó)家和地區(qū)都將其列為檢疫性病害，足見(jiàn)此病害的嚴(yán)重性。PSTVd在中國(guó)分布廣泛，一些染病地區(qū)馬鈴薯減產(chǎn)幅度高達(dá)80%。

由于PSTVd能夠隨著馬鈴薯的無(wú)性繁殖傳遞給后代，而且目前還很難通過(guò)莖尖剝離或者超低溫處理等方法將其徹底脫除，因此，目前控制該病害的最主要方法是通過(guò)嚴(yán)格的檢驗(yàn)檢疫，生產(chǎn)無(wú)毒種薯，從源頭上控制該病害的發(fā)生和傳播。因此，用于檢驗(yàn)PSTVd的技術(shù)就成為了控制該病害的關(guān)鍵所在。

目前，全世界普遍采用的檢測(cè)PSTVd的方法有生物學(xué)方法（接種鑒定）、電子顯微鏡技術(shù)、往返－聚丙烯酰 胺 凝 膠 電 泳（Return－polyacrylamide gel electrophoresis,R－PAGE）、核酸斑點(diǎn)雜交（Nucleic acid spot hybridization,NASH）、逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Reverse transcription－polymerase chain reaction, RT－PCR）和實(shí)時(shí)熒光定量 RT－PCR（Real－time Fluorescent Quantitative Reverse Transcription－polymerase Chain Reaction,FQ RT－PCR）等，這些檢測(cè)方法都各有利弊，我們應(yīng)首先了解這些方法的特點(diǎn)，然后根據(jù)自身?xiàng)l件等合理地選擇檢測(cè)方法，更好地控制馬鈴薯脫毒種薯和種苗的質(zhì)量。

1 檢測(cè)技術(shù)

1.1 生物學(xué)方法

傳統(tǒng)的生物學(xué)鑒定方法是以植物病原在寄主上的表現(xiàn)癥狀作為識(shí)別病害和鑒定病原的基礎(chǔ)。該方法一般分為目測(cè)法和指示植物法兩種，前者主要利用病原在寄主上的癥狀來(lái)區(qū)別寄主是否受到感染，指示植物法則是利用一些模式植物上出現(xiàn)的特征來(lái)鑒別是否存在病原感染的方法。1964年，Raymer等[1]利用番茄作為PSTVd的指示植物進(jìn)行PSTVd鑒定，該方法是利用生物學(xué)方法檢測(cè)PSTVd最基本、最早的方法。大體做法是在番茄長(zhǎng)到兩片真葉時(shí)，在27～30℃，10 000 Lx光照下進(jìn)行接種，接種后2～4周或更長(zhǎng)時(shí)間，觀察植株表現(xiàn)，感染PSTVd的植株一般會(huì)出現(xiàn)矮化，頂部新生葉片變小，扭曲，粗縮，下卷，葉片淡綠色，逐漸發(fā)生中脈和支脈壞死等癥狀。利用該方法還可鑒定PSTVd株系致病性的強(qiáng)弱，目前仍然是研究PSTVd及其相關(guān)領(lǐng)域不可或缺的基本方法。但該方法具有諸多缺點(diǎn)，如鑒定周期長(zhǎng)，受溫度、光照等環(huán)境條件影響大等，對(duì)于不同品種和環(huán)境有不同的表現(xiàn)，并且還存在潛伏侵染等情況，因此，此方法一般不適于日常檢測(cè)。

1.2 電子顯微鏡技術(shù)

20世紀(jì)70年代，Sogo等[2]就利用電子顯微鏡對(duì)PSTVd進(jìn)行了檢測(cè)和觀察，從而確定了PSTVd的形態(tài)和大小等信息，為PSTVd的相關(guān)研究工作打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。該方法具有快速、簡(jiǎn)單、直接等優(yōu)點(diǎn)，但是，該方法需要一定的專業(yè)電鏡操作技能，且電子顯微鏡體積龐大，要求高，需要專門(mén)的實(shí)驗(yàn)室安放，價(jià)格昂貴，一般的實(shí)驗(yàn)室不具備該設(shè)備，因此，不適于大面積推廣用于日常PSTVd檢測(cè)。

1.3 往返電泳法

一些研究者利用R－PAGE成功檢測(cè)PSTVd[3,4]，該方法后來(lái)被廣泛應(yīng)用于PSTVd的檢測(cè)。該方法克服了生物學(xué)方法需要周期長(zhǎng)，受環(huán)境影響大的缺點(diǎn)，同時(shí)不需要像電子顯微鏡那樣的設(shè)備，在一段時(shí)間內(nèi)得到了廣泛的應(yīng)用。之后又對(duì)該方法進(jìn)行了改進(jìn)，使之可根據(jù)PSTVd電泳遷移率來(lái)鑒定PSTVd的致病性。目前，該方法仍在一定范圍內(nèi)應(yīng)用。然而，雖然該方法克服了以往檢測(cè)技術(shù)的諸多缺點(diǎn)，但該技術(shù)仍然存在一定的不足，如檢測(cè)靈敏度低，一次性檢測(cè)樣品量小等，不適于大量樣品的檢測(cè)。

1.4 核酸斑點(diǎn)雜交

隨著生物技術(shù)突飛猛進(jìn)的發(fā)展，越來(lái)越多的生物技術(shù)可以被應(yīng)用于PSTVd的檢測(cè)，國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者都開(kāi)始應(yīng)用NASH檢測(cè)PSTVd[5－7]。此法基于互補(bǔ)堿基的結(jié)合，因而可靠、靈敏度高。1989年以后，32P和生物素先后被應(yīng)用于cDNA探針的標(biāo)記[8,9]，但是，32P半衰期短，有放射性危害，對(duì)操作及廢物處理要求嚴(yán)格，而生物素成本較高，因此，這兩種方法都沒(méi)有廣泛普及。1992年，何小源和周廣和[10]用光敏生物素標(biāo)記了PCR擴(kuò)增后的PSTVd－cDNA探針。1997年，董江麗等[11]用長(zhǎng)臂光敏生物素標(biāo)記cDNA探針，克服了之前的一些弊端，使該技術(shù)更具實(shí)用性。2009年，邱彩玲等[12]利用地高辛標(biāo)記的探針及其核酸斑點(diǎn)雜交檢測(cè)PSTVd試劑盒的成功研制為核酸斑點(diǎn)雜交法檢測(cè)PSTVd開(kāi)拓了更為簡(jiǎn)便的途徑。經(jīng)過(guò)諸多學(xué)者的共同努力，現(xiàn)在利用NASH方法檢測(cè)PSTVd已經(jīng)變得非常簡(jiǎn)便，一次可以檢測(cè)大量樣品，靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，對(duì)環(huán)境友好，對(duì)操作人員沒(méi)有危害，是日常檢測(cè)PSTVd非常便利且有效的方法。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

RT－PCR是指在對(duì)類病毒RNA基因組進(jìn)行擴(kuò)增之前需要先用逆轉(zhuǎn)錄酶（Reverse transcriptase）在引物的引導(dǎo)下先合成與類病毒基因組互補(bǔ)的DNA（Complementary DNA,cDNA），然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增的方法。該方法具有靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，但是，非特異性擴(kuò)增是RT－PCR方法原理上的缺陷，容易受到試劑、引物等的污染而出現(xiàn)假陽(yáng)性，因此檢測(cè)結(jié)果往往不可靠，但是對(duì)于類病毒的基因組序列分析卻非常重要。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR

FQ RT－PCR是檢測(cè)低豐度RNA的敏感方法，該方法是在RT－PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種靈敏度較高的核酸定量技術(shù)，該技術(shù)已經(jīng)被成功的用于檢測(cè)植物病毒和馬鈴薯紡錘塊莖類病毒類病毒。這種方法檢測(cè)靈敏度高，且可以定量。然而，Real－time PCR儀及相關(guān)的試劑和耗材價(jià)格昂貴，檢測(cè)成本非常高，而且對(duì)于種薯和種苗質(zhì)量檢測(cè)來(lái)講，并不需要知道其感染PSTVd的濃度，只需要知道感染與否即可，因此，此方法一般不用于日常檢測(cè)，僅適于有特殊要求或者非常重要的資源的檢測(cè)。

除上述幾種常見(jiàn)的檢測(cè)方法以外，還有基因芯片、寡核苷酸微點(diǎn)陣技術(shù)等，只是這些方法目前普及率比較低。

2 如何選擇合適的檢測(cè)技術(shù)

對(duì)于種薯和種苗生產(chǎn)者來(lái)說(shuō)，為了生產(chǎn)合格的脫毒種薯和種苗，PSTVd是必須要檢測(cè)的一個(gè)重要參數(shù)。那么，面對(duì)眾多的檢測(cè)技術(shù)和方法，我們應(yīng)該如何選擇符合自己需要的檢測(cè)技術(shù)呢？以下幾方面是要重點(diǎn)考慮的因素。

2.1 檢測(cè)目的及要求

檢測(cè)目的和要求是我們首先要考慮的問(wèn)題，對(duì)于即將用于擴(kuò)繁的種苗來(lái)講，此階段需要檢測(cè)的樣品數(shù)量少且尤為重要，因此，在條件允許的情況下，應(yīng)盡可能選擇靈敏度較高的技術(shù)，以確保擴(kuò)繁種苗的質(zhì)量，避免后期造成無(wú)法挽回的損失。如果是已經(jīng)擴(kuò)繁到很多種苗或者進(jìn)行田間大范圍檢測(cè)，適宜采用靈敏度較高且一次可以檢測(cè)大量樣品的方法，如NASH，這樣既可保證靈敏度，又可節(jié)約人力物力，提高工作效率，節(jié)約成本。

2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)施及經(jīng)費(fèi)條件

在選擇檢測(cè)技術(shù)的時(shí)候，實(shí)驗(yàn)條件和設(shè)施是必須考慮的因素之一，不同的檢測(cè)方法需要不同的設(shè)備，要全方位考慮問(wèn)題，作出適當(dāng)?shù)倪x擇，在保證檢測(cè)質(zhì)量的同時(shí)盡可能減少不必要的經(jīng)費(fèi)支出。

當(dāng)然，上述參考意見(jiàn)僅考慮技術(shù)層面等相關(guān)的問(wèn)題，并沒(méi)有涉及法律、法規(guī)等因素，因此，種薯和種苗生產(chǎn)者還應(yīng)深入學(xué)習(xí)相關(guān)的法律法規(guī)，熟悉各種相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)規(guī)程，在確保種薯、種苗質(zhì)量的同時(shí)，合理地保護(hù)自己和他人的合法利益。

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[2] Sogo J M,Koller T,Diener T O.Potato spindle tuber viroid:X. Visualization and size determination by electron microscopy[J]. Virology,1973,55(1):70－80.

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[9]張鶴齡,曹先維,Ilse Balbo,等.用生物素標(biāo)記cDNA探針檢測(cè)馬鈴薯紡錘塊莖類病毒[J].病毒學(xué)報(bào)，1989,5(1):72－75.

[10]何小源,周廣和.應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增和光敏生物素標(biāo)記的cDNA探針檢測(cè)馬鈴薯紡錘塊莖類病毒[J].病毒學(xué)報(bào)，1992,8(4):337－341.

[11]董江麗,哈斯阿古拉,張彤,等.用長(zhǎng)臂光敏生物素標(biāo)記的cDNA探針核酸斑點(diǎn)雜交檢測(cè)馬鈴薯紡錘塊莖類病毒[J].內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,1997,28(4):537－540.

[12]邱彩玲,劉尚武,王紹鵬,等.馬鈴薯類病毒的危害及NASH檢測(cè)試劑盒的研制[M]//.陳伊里,屈冬玉.馬鈴薯產(chǎn)業(yè)與糧食安全.哈爾濱:哈爾濱工程大學(xué)出版社,2009.