徐心純 成建萍 周國雄

超聲微泡造影劑與胰腺癌靶向診斷和治療的研究進展

徐心純 成建萍 周國雄

胰腺癌是惡性程度極高的消化道腫瘤，預(yù)后很差，其病因考慮與大量吸煙、糖尿病、慢性胰腺炎、肥胖、基因突變等有關(guān)[1]。因胰腺癌起病隱匿，且早期癥狀不明顯，使大多數(shù)患者失去手術(shù)治療機會，即使將腫瘤切除，術(shù)后極易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。胰腺癌分子靶向治療是近年來腫瘤治療研究的熱點。超聲微泡造影劑是一種新的安全有效的載體，可從分子水平上介導(dǎo)腫瘤的靶向診斷和治療。

一、靶向超聲微泡的研究進展

超聲微泡由外殼和內(nèi)充氣體兩部分組成。內(nèi)充氣體在超聲波作用下產(chǎn)生非線性回聲，從而可實現(xiàn)微泡的超聲下顯影，由于其具有較強的回波反射性能，因此被認(rèn)為是目前最好的人體微血管內(nèi)造影材料。目前研究的第三代超聲微泡造影劑的直徑1～8 μm，采用脂質(zhì)、白蛋白、表面活性劑或高分子多聚物作為外殼，它能在血管腔中保持相對穩(wěn)定并可以順利通過肺循環(huán)[2]，實現(xiàn)全身器官組織、病變回聲增強從而提高組織顯影的清晰度[3]。

普通微泡造影劑因缺乏對病變組織的特殊親和力，不能有效駐留靶組織，為此人們開始研究具有特異性的靶向超聲微泡。靶向超聲造影劑不再需要白細(xì)胞的介導(dǎo)，而是將特異性抗體或配體連接到聲學(xué)造影劑表面，依靠抗原-抗體或配體-受體之間的特異性結(jié)合，通過血液循環(huán)積聚到特異的靶器官或靶組織，從而使器官或組織在超聲影像中得到特異性的增強或局部靶向治療作用[4]。與普通微泡相比，靶向超聲微泡通過免疫反應(yīng)或生物反應(yīng)，從分子水平識別并結(jié)合于病變部位，避免了吞噬細(xì)胞對微泡的破壞，因而具有高度的特異性和靶向性。

二、靶向超聲微泡產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的機制

造影劑超聲微泡的生物學(xué)特性使其成為一種理想的基因或藥物遞送載體。將少量攜帶基因或藥物的微泡經(jīng)外周靜脈或局部注射后,微泡流經(jīng)靶向部位時進行超聲,即得到超聲影像[5]。當(dāng)超聲影像圖證明超聲準(zhǔn)確定位于靶向部位時,增加聲壓使之達到一定強度,即可使微泡破裂產(chǎn)生空化效應(yīng)[6]。空化效應(yīng)是指液態(tài)中的微小氣泡在超聲的激發(fā)下，氣泡不斷振動、膨脹、收縮以致破裂的動力學(xué)過程，包括低強度超聲場作用下引發(fā)的微射流及輻射壓力的穩(wěn)態(tài)空化和高強度超聲下微泡急劇膨脹收縮引起微泡爆裂的瞬態(tài)空化，此過程中瞬間釋放大量聲能，使局部產(chǎn)生高溫、高壓，隨之產(chǎn)生光效應(yīng)和氧自由基等二次效應(yīng),使微血管破裂 ,血管內(nèi)皮細(xì)胞收縮，細(xì)胞間隙增寬，微血管壁的通透性增大。1997年Bao使用低聲壓(0.2 MPa)超聲波對含微泡的大田鼠卵巢細(xì)胞進行輻照，細(xì)胞膜就可以對大分子暫時開放，爾后再封閉起來。在細(xì)胞膜暫時開放期間，細(xì)胞外的大分子即可進入細(xì)胞內(nèi)，被細(xì)胞捕獲，并稱此現(xiàn)象為聲孔效應(yīng)[7]。聲孔效應(yīng)可使細(xì)胞出現(xiàn)“永久”或“暫時”的微孔(與微泡劑濃度和超聲劑量有關(guān))，從而導(dǎo)致細(xì)胞通透性增加，毛細(xì)血管損傷等。這些現(xiàn)象有利于靶向超聲微泡所攜帶的抗腫瘤物質(zhì)進入血管腔隙，從而進一步提高微泡對腫瘤的靶向診斷和治療作用。

三、靶向超聲微泡在胰腺癌診斷和治療中的應(yīng)用進展

1．超聲微泡用于胰腺癌的診斷：超聲微泡造影劑的成像技術(shù)原理主要是利用聲波對氣體反射比液體大近1000倍的原理及微泡的非線性聲學(xué)效應(yīng)，通過聲衰減、聲速的改變和增強后散射等方式改變聲波與組織間的吸收、反射和折射等相互作用，使超聲回聲增強，從而提高灰階成像的對比分辨率和空間分辨率，達到有利于診斷疾病的目的。二維、彩色多普勒超聲及能量多普勒超聲能對較大的胰腺癌病灶進行診斷，但對早期小的胰腺癌病灶且分散的病灶存在困難。超聲微泡造影對血液回聲的增強，彌補了多普勒對不典型腫瘤及腫瘤中低速低流量血管的顯示不良，可充分顯示腫瘤新生血管網(wǎng)。

國內(nèi)外有關(guān)靶向超聲微泡在胰腺腫瘤方面的研究和報道逐漸增多，已顯示出巨大前景。Linder等[8]研究表明，靶向微泡可用于腫瘤血管和組織的顯影。靜脈注射Levovist后可觀察到小血管內(nèi)的低速血流，從而獲得較造影前更豐富的血流信息，且病灶內(nèi)多普勒信號強度的最大值和平均值較造影前有明顯增強。徐慧等[9]對42例胰腺占位性病變患者進行的即時超聲微泡造影檢查顯示惡性病變、良性病變與實質(zhì)灌注(包括灌注早期、灌注晚期)3組間的造影劑始增時間、始- 峰時間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。D′Onofrio等[10]研究了超聲造影檢查及CT增強檢查，在對43例患者進行術(shù)后病理微血管密度檢查后發(fā)現(xiàn)，超聲造影檢查所提示的胰腺腫瘤類別與病理結(jié)果相關(guān)指數(shù)很高(OR=0.914)，而增強CT檢查結(jié)果與病理結(jié)果的OR僅為0.635，因此超聲造影能更好地反映胰腺腫瘤內(nèi)部的血管分布。Hocke等[11]收集86例病例進行超聲微泡對局灶性胰腺炎與胰腺癌鑒別診斷價值的研究，其中胰腺癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)為：常規(guī)能量多普勒檢查未見血流信號，而在使用超聲微泡后有較短動脈顯影，但整個造影增強過程均未見靜脈血流信號顯示。利用微泡可有效改善超聲對腫瘤血管的檢測、更準(zhǔn)確評價腫瘤血管，提高了胰腺良、惡性腫瘤的診斷及鑒別診斷水平，具有廣泛的應(yīng)用價值和臨床意義。

2．超聲微泡用于胰腺癌的治療：目前研究微泡主要通過作為藥物及基因的載體和介導(dǎo)血管栓塞兩方面發(fā)揮腫瘤治療作用。微泡攜帶藥物或基因可能有4種方法：(1)將藥物或基因黏附于微泡造影劑微殼中。(2)通過靜電作用，將帶電荷藥物或基因非共價結(jié)合到造影劑表面。(3)把藥物或基因整合入微泡內(nèi)部。(4)在造影劑外殼中形成一層油脂物質(zhì)包繞微泡，然后將疏水性藥物整合入這層油脂中。為使攜帶基因或藥物的超聲微泡造影劑具有靶向性，方法有[12]：(1)利用微泡本身外殼的化學(xué)和電荷特性使之滯留于病灶部位；(2)利用分子橋作用,將疾病相關(guān)的單克隆抗體與微泡結(jié)合，從而間接使微泡與病灶部位表達的相關(guān)抗原結(jié)合；(3)在微泡表面連接特異性抗體或配體,使之結(jié)合到病灶部位細(xì)胞表達的特異性抗原或受體上，達到靶向性顯影和治療的目的。

目前研究較為廣泛的是將特異性好、活性高的配體或抗體牢固連接到微泡表面，這也是制備靶向微泡的關(guān)鍵技術(shù)所在。超聲微泡介導(dǎo)的腫瘤靶向治療有低免疫原性、低毒性、低侵襲性、無創(chuàng)、器官組織特異性、可重復(fù)應(yīng)用等諸多優(yōu)點，已成為各種疾病治療手段中具有潛力的新技術(shù)。將攜帶基因或細(xì)胞毒性藥物的靶向微泡從外周靜脈或局部注射，當(dāng)微泡特異性結(jié)合到腫瘤部位時，進行超聲輻照破壞微泡，使基因或藥物局部釋放，達到提高局部藥物或基因的濃度、避免藥物被肝臟攝取、延緩藥物的釋放、減少給藥次數(shù)、減小給藥劑量、增加藥物療效[13]和減輕全身不良反應(yīng)的目的，而且還可以通過改變超聲儀器各個參數(shù)的設(shè)置，控制藥物釋放速度，進行實時監(jiān)控，減少藥物或基因破壞，節(jié)約用量。

紫杉醇是目前臨床治療腫瘤的常用化療藥物，也是目前最有前景的廣譜抗癌藥物之一。紫杉醇類藥物能促進微管聚合，同時抑制其解聚，使微管束排列異常，從而使紡錘體失去其正常功能，細(xì)胞有絲分裂停止。楊健等[14]發(fā)現(xiàn)多烯紫杉醇對人胰腺癌BxPC3細(xì)胞有明顯的細(xì)胞毒性作用，載多烯紫杉醇脂質(zhì)微泡聯(lián)合靶向超聲微泡破裂技術(shù)能明顯降低BxPC3細(xì)胞的S期細(xì)胞比例和細(xì)胞增殖指數(shù)，使腫瘤細(xì)胞活性顯著降低，同時能增強對BxPC3細(xì)胞的G2/M期阻滯作用，提高BxPC3細(xì)胞凋亡率。楊春江等[15]對載多烯紫杉醇脂質(zhì)微泡體內(nèi)外毒性實驗研究中發(fā)現(xiàn)，對小鼠直接注射紫杉醇后會出現(xiàn)急性中毒反應(yīng)，大劑量注射后急性中毒反應(yīng)會更加嚴(yán)重，而注射載紫杉醇脂質(zhì)微泡后僅有少數(shù)出現(xiàn)輕微反應(yīng)，大部分小鼠無任何反應(yīng)。由此可見，超聲微泡作為載體顯著降低了紫杉醇因受劑型約束而產(chǎn)生的不良作用，且經(jīng)一定能量超聲輻照后，所載紫杉醇仍能保持較強的抗腫瘤活性。劉瑤等[16]實驗證實，紫杉醇可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡，但經(jīng)超聲輻照載紫杉醇的微泡造影劑后腫瘤細(xì)胞的凋亡率更高，且隨著時間的延長對胰腺癌的抑制作用也增強。10-羥基喜樹堿與傳統(tǒng)抗腫瘤藥物相比，所需藥物劑量低，但其穩(wěn)定性和水溶性差，半衰期短。嚴(yán)思靜等[17]成功制備了載10-羥基喜樹堿脂質(zhì)超聲微泡，將10-羥基喜樹堿包裹于磷酯雙分子層的壁上，解決了以上難題，且提高了藥物包封率，經(jīng)超聲輻照后藥物釋放量增加，為后期的腫瘤治療奠定了基礎(chǔ)。Rapoport等[18]制備的變相型多功能納米粒子，首先以納米級微球的形式攜帶抗癌藥物穿過血管內(nèi)皮達到腫瘤組織，然后內(nèi)部的全氟戊烷氣化轉(zhuǎn)變?yōu)檩d藥微泡，經(jīng)超聲輻照后會更有效地殺傷腫瘤細(xì)胞。

四、前景和展望

超聲微泡介導(dǎo)的藥物治療方法提高了靶向性，降低了藥物的不良反應(yīng)，這將會成為胰腺癌診斷和治療的新途徑。但目前需要解決的問題包括：(1)構(gòu)建更小、穩(wěn)定性更好、更安全的微泡；(2)使有組織特異性的抗原、藥物更高效牢固地結(jié)合在微泡表面；(3)超聲破壞微泡對周圍組織產(chǎn)生一定的有害效應(yīng)，要將這一技術(shù)應(yīng)用于臨床，還要對微泡劑量、濃度和超聲輻照參數(shù)進行優(yōu)化，使其盡量與診斷超聲的條件相一致，提高對人體的安全性。總的來說，靶向超聲微泡在胰腺癌診斷和治療的基礎(chǔ)和臨床研究向人們展示出了美好的前景，可以預(yù)測，隨著分子影像學(xué)的發(fā)展，該技術(shù)將為胰腺癌診斷和治療提供全新的手段。

[1] Loos M,Kleeff J,Friess H,et al.Surgical treatment of pancreatic cancer.Ann N Y Acad Sci, 2008,1138:169-180.

[2] Rasisinghani A,DeMaria AN.Physical principles of microbubble ultrasound contrast agents.Am J Cardiol,2002,90:3J-7J.

[3] ter Haar GR.Ultrasonic contrast agents:safty considerations reviewed.Eur J Radiol,2002,41:217-221.

[4] Klibanov AL.Microbubble contrast agents:targeted ultrasound imaging and ultrasound-assisted drug-delivery applications.Invest Radiol,2006,41:354-362.

[5] Zhao YZ,Liang HD,Mei XG,et al.Preparation,characterization and in vivo observation of phospholipid-based gasfilled microbubbles containing hirudin.Ultrasound Med Biol,2005,31:1237-1243.

[6] Frenkel V.Ultrasound mediated delivery of drugs and genes to solid tumors.Adv Drug Deliv Rev,2008,60:1193-1208.

[7] Bao S,Thrall BD,Miller DL.Trasfection of a reporter plasmid into cultured cells by sonopotation in vitro.Ultrasound Med Biol,1997,23:953-959.

[8] Linder JR,Song J,Christiansen J,et al.Ultrasound assessment of inflammation and renal tissue injury with microbubbles targeted to P-selectin.Circulation,2001,104:2107-2112.

[9] 徐慧，馮蕾.即時超聲微泡造影劑診斷胰腺占位性病變的價值.中國醫(yī)學(xué)影像學(xué)雜志,2011,19：650-654.

[10] D′Onofrio M,Malago R,Zamboni G,et al.Contrast-enhanced ultrasonography better indentifies pancreatic tumor vascularization than helical CT.Pancreatology,2005,5:398-402.

[11] Hocke M,Menges M,Topalidis T,et al.Contrast-enhanced endoscopic ultrasound in discrimination between benign and malignant mediastinal and abdominal lymphnodes nodes.J Cancer Res Clin Oncol,2008,134:473-480.

[12] Klibanov AL. Ligand-carrying gas-filled microbubbles:ultrasound conrtast aagents for targeted molecular imaging.Bioconjug Chem, 2005,16:9-17.

[13] Unger EC,Porter T,Culp W,et al.Therapeutic application of lipid-coated microbubbles.Adv Drug Deliv Rev,2004,56:1291-1314.

[14] 楊健，康娟，曾研，等.載多烯紫杉醇脂質(zhì)微泡增強人胰腺癌BxPC3細(xì)胞的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2012,32:618-621.

[15] 楊春江，王志剛，賴天霞，等.載紫杉醇脂質(zhì)微氣泡體內(nèi)外毒性試驗研究.中國超聲醫(yī)學(xué)雜志,2006,22：481-483.

[16] 劉瑤，康娟，吳小翎，等.載紫杉醇超聲微泡造影劑對人肝癌細(xì)胞株HepG2增殖影響及誘導(dǎo)凋亡作用研究.中國超聲醫(yī)學(xué)雜志,2008,24：676-678.

[17] 嚴(yán)思靜，李攀，袁佩，等.載10-羥基喜樹堿脂質(zhì)超聲微泡的處方制備及一般特性研究.中國醫(yī)學(xué)影像技術(shù),2009,25：574-577.

[18] Rapoport N,Gao Z,Kennedy A.Multifuctional nanoparticles for combining ultrasonic tumor imaging and targeted chemotherapy, J NatI Cancer Inst,2007,99:1095-1106.

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.05.021

226001 江蘇南通，南通大學(xué)附屬醫(yī)院

徐心純，Email:434658501@qq.com

2012-12-14)

(本文編輯：屠振興)