王燕茹，張　育，沈維干，尚　辰，馬瑩瑩，方振玉

(揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 江蘇省蘇北人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，江蘇揚(yáng)州 225001)

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是以關(guān)節(jié)病變?yōu)橹鞯穆匝仔约膊?，可?dǎo)致關(guān)節(jié)畸形。RA具有明顯致殘率，在其自然病程中，5～10年致殘率為60%，30年致殘率達(dá)90%，35% RA患者在10年內(nèi)喪失工作能力[1]?？寡字委熓蔷徑釸A患者臨床癥狀的重要手段。然而，RA治療更重要的是抑制關(guān)節(jié)破壞，防止關(guān)節(jié)變形，保護(hù)關(guān)節(jié)功能。目前，許多新方法使RA炎性反應(yīng)得以很好地控制，但仍不能完全阻斷關(guān)節(jié)破壞。如何干預(yù)并有效預(yù)防RA患者關(guān)節(jié)破壞、促進(jìn)骨修復(fù)、改善患者生活質(zhì)量是風(fēng)濕病學(xué)者亟待解決的一個(gè)難題。

研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞核因子κB受體活化因子(receptor-activator of nuclear factor kappa bata，RANK)、細(xì)胞核因子κB受體活化因子配體(receptor-activator of nuclear factor kappa bata ligand，RANKL)和骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)是破骨細(xì)胞生成、活化、發(fā)育、激活及成熟過(guò)程中的關(guān)鍵性調(diào)控因子[2]。RANKL屬于腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)家族，其受體包括兩種，一種是存在于破骨細(xì)胞前體細(xì)胞膜表面的RANK，RANKL與RANK結(jié)合可促進(jìn)破骨細(xì)胞分化、成熟；另一種受體是OPG，OPG與RANKL的結(jié)合能力較RANK強(qiáng)，可以競(jìng)爭(zhēng)性地阻礙RANKL與RANK的結(jié)合，達(dá)到抑制破骨細(xì)胞分化的目的[2]。研究表明，RA患者骨侵蝕部位成骨細(xì)胞的骨形成減弱[3]。TNF-α是控制疾病的關(guān)鍵因子之一，其可使參與骨吸收的破骨細(xì)胞生成增多，同時(shí)抑制參與骨重建的成骨細(xì)胞分化，導(dǎo)致軟骨下骨組織破壞[3]。已有研究證實(shí)，金雀異黃素(genistein，Gen)對(duì)RA有治療作用[4]。本研究探討Gen對(duì)RA患者成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)OPG/RANKL/RANK通路的影響及機(jī)制。

材料和方法

試劑及細(xì)胞

人RA-FLS(408RA-05a)購(gòu)自廣州吉妮歐生物有限公司；Gen購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司提供；兔Anti-OPG購(gòu)自美國(guó)SANTA CRUZ公司；兔Anti-RANKL購(gòu)自美國(guó)SANTA CRUZ公司；兔Anti-RANK購(gòu)自美國(guó)SANTA CRUZ公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體及熒光標(biāo)記的二抗購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

分組

根據(jù)3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇Gen對(duì)RA-FLS細(xì)胞的非抑制濃度，具體分為(1)對(duì)照組：RA-FLS細(xì)胞；(2)TNF-α組：RA-FLS細(xì)胞+TNF-α(10 ng/ml)；(3)TNF-α+Gen組：RA-FLS細(xì)胞+TNF-α(10 ng/ml)+Gen(50 μM)；(4)Gen組：RA-FLS細(xì)胞+Gen(50 μM)。

實(shí)驗(yàn)方法

取第4代RA-FLS，行細(xì)胞計(jì)數(shù)、調(diào)整細(xì)胞懸液，使細(xì)胞濃度達(dá)到5×105/ml，接種于直徑為10 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，分別加入預(yù)先配制好的Gen，分組同上述。37℃、5% CO2培養(yǎng)72 h后終止培養(yǎng)，收取細(xì)胞提蛋白，用蛋白印跡(Western blotting)法檢測(cè)Gen對(duì)RA-FLS細(xì)胞RANK、RANKL、OPG、雌激素受體(estrogen receptor α，ERα)表達(dá)的影響。應(yīng)用免疫熒光法檢測(cè)Gen影響RA-FLS內(nèi)ERα分布情況。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)FLS表面標(biāo)記。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)　　果

FLS形態(tài)觀察和鑒定

FLS貼壁前為圓形，復(fù)蘇4～6 h后開(kāi)始貼壁。24 h后均貼壁，并伸出生長(zhǎng)突，可見(jiàn)許多細(xì)胞呈梭形樹(shù)突狀生長(zhǎng)，有少量呈圓形生長(zhǎng)，胞質(zhì)突起細(xì)長(zhǎng)或較短，具有成纖維樣細(xì)胞的特性，細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)可呈旋渦狀分布(圖1)。

FLS表面標(biāo)記可見(jiàn)人RA-FLS有CD29、CD90高表達(dá)(圖2)。

Gen對(duì)FLS的RANKL/OPG/RANK系統(tǒng)及ERα表達(dá)的影響

Gen組、TNF-α組及TNF-α+Gen組細(xì)胞內(nèi)RANK蛋白表達(dá)量較對(duì)照組無(wú)明顯差異(P=0.302)，但OPG及RANKL蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P=0.002，P=0.031)。Gen組OPG/RANKL較對(duì)照組增高(P=0.002)。Gen組、TNF-α組及TNF-α+Gen組細(xì)胞內(nèi)ERα蛋白表達(dá)量與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.401)(圖3)。

Gen對(duì)人RA-FLS內(nèi)ERα入核的影響

Gen作用RA-FLS 24 h后，與對(duì)照組比較，Gen組RA-FLS內(nèi)ERα細(xì)胞核處熒光強(qiáng)度較強(qiáng)；與雌激素組比較，Gen組RA-FLS熒光強(qiáng)度類(lèi)似(圖4)。

討　　論

RA患者可因骨質(zhì)丟失導(dǎo)致畸形關(guān)節(jié)疼痛、進(jìn)行性功能障礙、骨折發(fā)生率增加、死亡率升高。現(xiàn)在研究發(fā)現(xiàn)，破骨細(xì)胞是RA骨質(zhì)和關(guān)節(jié)破壞的中樞效應(yīng)細(xì)胞，RANKL/OPG/RANK是調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞募集和活化的重要因子。正常骨組織中，骨吸收重建主要通過(guò)成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞發(fā)揮作用，而RANK/RANKL/OPG通路是連接骨形成和骨吸收的重要因子，RANKL/OPG的平衡決定了破骨細(xì)胞活化和增殖水平[5]。RANKL分為膜結(jié)合狀態(tài)與可溶性狀態(tài)，主要由成骨細(xì)胞、免疫細(xì)胞和一些腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生，其結(jié)合于破骨細(xì)胞表面受體RANK，通過(guò)破骨基因和活化多個(gè)核細(xì)胞刺激骨質(zhì)吸收。OPG屬于TNF受體超家族，具有拮抗RANKL的生物功能。OPG是成骨細(xì)胞分泌RANKL誘餌受體，可減少RANKL與RANK的結(jié)合及骨質(zhì)吸收，其存在于成人肺、心、腎、肝臟、胸腺、淋巴結(jié)、骨髓、成骨細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞[6]。維生素D3、白介素(interleukin，IL)-1α、IL-1β、TNF-α、TNF-β、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein 2，BMP2)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β、17-雌二醇及Wnt信號(hào)路可調(diào)節(jié)OPG的表達(dá)。

RA患者的關(guān)節(jié)炎性反應(yīng)由多種細(xì)胞及細(xì)胞因子引起，滑膜細(xì)胞是其中較為重要的細(xì)胞，其可通過(guò)分泌趨化因子及黏附因子誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等聚集、活化。RA-FLS具有侵襲性，可在RA發(fā)病過(guò)程中可從靜止的、相對(duì)無(wú)細(xì)胞組織的細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榛卧鲩L(zhǎng)、侵入組織的、且具有免疫活性的細(xì)胞，可侵襲細(xì)胞外基質(zhì)，并致關(guān)節(jié)破壞進(jìn)一步加劇。RA-FLS主要通過(guò)產(chǎn)生細(xì)胞因子維持炎性環(huán)境及蛋白酶，并導(dǎo)致軟骨破壞，也可遷移至關(guān)節(jié)軟骨并通過(guò)分泌骨質(zhì)金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶和組織蛋白酶破壞基質(zhì)[7-8]。Herenius等[9]認(rèn)為，破骨基因活化通路存在于炎性關(guān)節(jié)病中，F(xiàn)LS是骨和關(guān)節(jié)破壞的關(guān)鍵細(xì)胞[9]。由于RA-FLS在RA發(fā)病中的重要作用，本次研究主要選取了RA-FLS為研究對(duì)象，探討Gen影響下RA-FLS內(nèi)RANKL/OPG/RANK通路的改變情況，揭示其對(duì)調(diào)控破骨細(xì)胞可能影響。蛋白印跡檢測(cè)結(jié)果示，Gen可以上調(diào)人RA-FLS中OPG及RANKL，且對(duì)OPG的上調(diào)作用更強(qiáng)，Gen組OPG/RANKL增高；但Gen對(duì)RANK表達(dá)無(wú)明顯影響。上述結(jié)果提示，Gen可能通過(guò)影響OPG/RANKL平衡發(fā)揮其抑制RA骨質(zhì)破壞作用。

TNF-α是引起RA關(guān)節(jié)炎性反應(yīng)的重要因子，其可以通過(guò)刺激多種細(xì)胞活化、分泌細(xì)胞因子引起關(guān)節(jié)炎炎性反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α組及TNF-α+Gen組RA-FLS內(nèi)RANKL及OPG較對(duì)照組均有上調(diào)，且TNF-α+Gen組OPG上調(diào)幅度更大，提示Gen可以抑制TNF-α誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)破壞。

Gen為植物雌激素，具有多種生物學(xué)效應(yīng)，并具有酪氨酸激酶抑制劑的作用[10]。目前，許多研究認(rèn)為，Gen具有雌激素樣作用，能抑制糖皮質(zhì)激素及雙側(cè)卵巢切除誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型的骨質(zhì)疏松進(jìn)展[11-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，Gen作用的RA-FLS在細(xì)胞核處熒光強(qiáng)度更強(qiáng)，提示Gen可能通過(guò)與雌激素受體結(jié)合，轉(zhuǎn)入核內(nèi)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。同時(shí)，免疫印跡檢測(cè)結(jié)果提示Gen作用FLS后ERα表達(dá)量無(wú)明顯變化，提示Gen可能主要通過(guò)調(diào)節(jié)ERα功能、而非改變表達(dá)量調(diào)節(jié)FLS功能。

體內(nèi)環(huán)境下RA發(fā)病過(guò)程受到多種細(xì)胞及其分泌細(xì)胞因子共同影響，較體外環(huán)境更為復(fù)雜。有研究發(fā)現(xiàn)，脂多糖等因子可誘導(dǎo)RANKL的生成增加[14]。Romas等[15]發(fā)現(xiàn)隨著體外培養(yǎng)RA-FLS代數(shù)增加，F(xiàn)LS細(xì)胞表面RANKL將減少，認(rèn)為這種表現(xiàn)可能與體外FLS細(xì)胞離開(kāi)關(guān)節(jié)內(nèi)炎性環(huán)境相關(guān)。

(本文圖1～4見(jiàn)插頁(yè)Ⅰ)

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