董 林，王艷萍，張春玲，沈志強(qiáng)＊

（1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600；2.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州256600）

非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）是一種蟲(chóng)媒傳播的DNA 病毒，是引起非洲豬瘟的病原［1］，以全身出血、呼吸障礙和神經(jīng)癥狀、高死亡率為主要特征［2］。ASFV 基因編碼160～170開(kāi)放閱讀框，根據(jù)基因序列差異分為22個(gè)基因型，其基因組DNA 大小為170 000～190 000nt［3］。ASFV 開(kāi)放閱讀框VP73編碼蛋白是其主要結(jié)構(gòu)蛋白，不同毒株間同源性可達(dá)97.8%～100%［4］，是保守性最高的編碼基因。Pastor等［5］研究發(fā)現(xiàn)，ASFV 至少8 個(gè)血清型，不同毒株誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的VP73抗體的相應(yīng)抗原性十分保守，且VP73蛋白占整個(gè)病毒結(jié)構(gòu)蛋白的32%左右，是ASFV 血清學(xué)診斷的良好候選結(jié)構(gòu)蛋白。

ASF流行病學(xué)監(jiān)測(cè)顯示，世界范圍內(nèi)ASF 流行地域呈現(xiàn)不斷擴(kuò)散趨勢(shì)，流行毒株基因組變異日趨明顯，且軟蜱在ASFV 流行和傳播中十分重要［6］。但目前國(guó)內(nèi)還未見(jiàn)該病的相關(guān)報(bào)道，并且跨境傳入風(fēng)險(xiǎn)不斷增大。因此，建立快速、準(zhǔn)確的ASFV 檢測(cè)方法十分必要。由于國(guó)家法律禁止該類(lèi)活病毒引進(jìn)，使得利用全病毒進(jìn)行研究的常規(guī)手段受到限制，所以本試驗(yàn)利用人工合成VP73主要抗原表位區(qū)，體外構(gòu)建ASFV 重組抗原表達(dá)載體，試圖獲得ASFV 病毒抗原蛋白的方法，以期為建立快速、安全的診斷和檢驗(yàn)ASFV 方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體和菌株 感受態(tài)細(xì)胞DH5α、BL21（DM3）表達(dá)菌、pGEX－KG表達(dá)載體均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 10×PCR Buffer、dNTP、Taq 酶、DL 2 000DNA Marker、EcoRI和SalI限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、IPTG 誘導(dǎo)劑、低分子量蛋白質(zhì)Marker均購(gòu)自大連寶生物工程公司；胰蛋白胨、酵母提取物為OXID公司產(chǎn)品；高純度質(zhì)粒小量制備試劑盒、多功能DNA 純化回收試劑盒購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；鼠抗GST 單克隆抗體，兔抗鼠－HRP，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）購(gòu)自Sigma公司。

1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)血清 ASFV 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清、參考血清由英國(guó)Reading University惠贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 ASFV VP73主要抗原區(qū)基因的人工合成

根據(jù)GenBank（登錄號(hào)：S89966）中ASFV VP73基因序列，考慮到大腸桿菌翻譯時(shí)的密碼子偏愛(ài)性，選取基因保守性強(qiáng)的抗原表位基因，由生工生物工程（上海）有限公司合成該段基因，構(gòu)建pUC57－VP73克隆載體，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及PCR 擴(kuò)增 依據(jù)選定合成的VP73基因序列，設(shè)計(jì)上下游引物，VP73－P1：5－CGGAATTCCAGGATGCTCCGATTCAG－3；VP73－P2：5－GCGTCGACATCGGTAAGAATAGGTTT－GC－3。上下游引物分別引入EcoRI、SalI內(nèi)切酶，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。以構(gòu)建的pUC57－VP73克隆載體為模板，PCR 擴(kuò)增VP73基因。PCR 反應(yīng)體系（25.0μL 體系）：10×PCR Buffer 2.5μL，dNTP2.0μL，上下游引物各1.0 μL，模板1.0μL，Taq酶0.5Taq酶，ddH2O 17.0 μL，總體系25.0μL。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃4 min；94 ℃45s，54 ℃35s，72 ℃45s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。PCR 擴(kuò)增完成后，取擴(kuò)增產(chǎn)物3.0 μL，于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)。

1.2.3 ASFV VP73 表達(dá)載體構(gòu)建 以pUC57－VP73質(zhì)粒為模板，用PCR 方法擴(kuò)增VP73基因片段，DNA 膠回收試劑盒回收目的PCR 基因產(chǎn)物，用內(nèi)切酶EcoRI、SalI同時(shí)對(duì)獲得基因片段和pGEXKG載體進(jìn)行雙酶切并回收DNA。使用T4DNA連接酶將VP73基因片段和pGEX－KG載體連接構(gòu)建重組質(zhì)粒。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定和序列測(cè)定。

1.2.4 VP73重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 提取鑒定好的重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化進(jìn)表達(dá)菌株BL21（DM3），挑選單個(gè)菌落，接種到5mL 含100μg／mL Amp的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。將過(guò)夜培養(yǎng)重組均以1%體積比接種到含100μg／mL Amp 液體LB培養(yǎng)基，37 ℃震蕩培養(yǎng)至OD600nm 為1.0時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG 至終濃度為1 mmol／L，37 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4h后，8 000rpm，離心15min，收集菌體，通過(guò)15%SDS－PAGE電泳評(píng)估表達(dá)效果。

1.2.5 VP7 重組蛋白純化 將重組質(zhì)粒表達(dá)菌BL21（DM3）接種到350 mL 液體LB 培養(yǎng)基，震蕩培養(yǎng)至OD600nm 為1.0 左右時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG 至終濃度為1 mmol／L，37 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4h后，離心收集菌體，SDS－PAGE 評(píng)估表達(dá)情況。8 000rpm，4 ℃，離心15min，收集菌體，超聲破碎，提取包涵體。使用8M 尿素使包涵體變性后，用GST－Protein Purtification Kit純化表達(dá)的目的蛋白，具體步驟按使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，SDS－PAGE 檢測(cè)純化效果。

1.2.6 VP73重組蛋白Western blot分析 收集純化的VP73重組蛋白進(jìn)行SDS－PAGE 電泳，將電泳的蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上，使用鼠抗GST 單克隆抗體為一抗，兔抗鼠－HRP 為二抗，進(jìn)行Western blot分析，以檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 VP73基因合成及PCR 擴(kuò)增結(jié)果

根據(jù)Genebank（登錄號(hào)：S89966）中ASFV VP73基因序列，合成其保守性強(qiáng)的349－777nt區(qū)段429nt大小基因。用引物VP73－P1、VP73－P2以合成基因?yàn)槟０?，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，取擴(kuò)增產(chǎn)物3.0 μL，于1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示在429 nt出現(xiàn)特異性目的條帶，大小與預(yù)期相符（見(jiàn)圖1）。

圖1 PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The amplified product of VP73gene by PCR

圖2 重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Digestion of pEGX－KG－VP73

2.2 重組表達(dá)載體構(gòu)建與鑒定

pEGX－KG－VP73 重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRI、SalI限制性內(nèi)切酶雙酶切鑒定，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)約429nt大小的DNA 片段，與預(yù)期結(jié)果一致，說(shuō)明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功（圖2）。重組質(zhì)粒經(jīng)序列測(cè)定顯示與Genebank（登錄號(hào)：S89966）中ASFVVP73基因序列同源性100%，與GenBank 中登錄的VP73基因同源性均在98%以上，說(shuō)明構(gòu)建的重組質(zhì)粒含VP73基因同源性好，這位PCR 試劑盒的應(yīng)用提供了保證。

2.3 VP73重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

重組質(zhì)粒pGEX－KG－VP73，轉(zhuǎn)化進(jìn)原核表達(dá)菌BL21（DM3）中，篩選陽(yáng)性菌落，誘導(dǎo)培養(yǎng)，收集菌體，經(jīng)15%SDS－PAGE 檢測(cè)，結(jié)果表明，在約41.0 Ku位置出現(xiàn)一條與預(yù)期分子量大小相符濃染蛋白條帶（圖3），而未經(jīng)誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌和經(jīng)誘導(dǎo)的空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌培養(yǎng)提取物沒(méi)有相應(yīng)目的條帶，表明VP73重組蛋白進(jìn)行了有效表達(dá)，表達(dá)量占菌體蛋白總量的35%左右。

2.4 VP73重組蛋白純化及表達(dá)活性鑒定

重組蛋白經(jīng)GST－Protein Purtification Kit純化后，15%SDS－PAGE電泳分析顯示目的蛋白獲得了良好純化，且純度可到90%以上（圖4）。Western blot分析，抗GST 抗體與轉(zhuǎn)染到NC 膜上的重組VP73重組蛋白可以反應(yīng)，經(jīng)DAB 顯色后在41Ku左右有一明顯特異性條帶，表明表達(dá)的VP73重組蛋白具有的良好表達(dá)活性（圖5）。

圖3 VP73重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)Fig.3 The SDS－PAGE of product of pEGX－KG－VP73

圖4 重組VP73蛋白純化Fig.4 Affinity chromatography purification of recombinant N protein

圖5 重組VP73蛋白Western blot分析Fig.5 Western blot of the recombinant VP73protein

3 討論

現(xiàn)階段我國(guó)還未有ASFV 傳入的報(bào)告，但跨境傳播的風(fēng)險(xiǎn)不斷增強(qiáng)，因此，研制基于體外誘導(dǎo)重組抗原的血清學(xué)診斷試劑，并應(yīng)用于進(jìn)口動(dòng)物ASFV口岸檢疫具有重要意義。目前，國(guó)外已研制了多種ASFV 基因及血清學(xué)診斷方法，并有產(chǎn)品投向市場(chǎng)；國(guó)內(nèi)學(xué)者也開(kāi)展了ASFV 診斷方法及檢疫的相關(guān)研究工作，但還都處在起步階段，急需開(kāi)展進(jìn)一步研究。VP73是ASFV 主要結(jié)構(gòu)蛋白，其穩(wěn)定性好，抗原保守性強(qiáng)，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，具有抗原保守性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，是建立ASFV 血清學(xué)快速診斷的良好候選抗原［9］。

本試驗(yàn)利用體外合成方法構(gòu)建了含ASFV VP73主要抗原表位基因片段，避免了直接操作ASFV 病毒所帶來(lái)的生物安全威脅。通過(guò)基因工程手段將獲得ASFV VP73基因片段克隆到pEGX－KG原核表達(dá)載體多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建ASFV VP73重組蛋白表達(dá)載體，進(jìn)行了體外誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白VP73，SDS－PAGED分析表明重組蛋白VP73獲得了高效表達(dá)，經(jīng)薄層掃描分析融合蛋白在菌體中的表達(dá)了約為35%。Western blot檢測(cè)顯示重組蛋白VP73能與ASFV 陽(yáng)性血清發(fā)生特異性顯色反應(yīng)，說(shuō)明其具有生物學(xué)活性。我們使用GST 親和層析純化試劑盒對(duì)目的蛋白進(jìn)行了純化，檢測(cè)表明純化后重組VP73蛋白純度達(dá)到90%以上，可基本滿足血清學(xué)診斷抗原需要?，F(xiàn)階段，我們正在研制基于重組VP73蛋白的ELISA 等血清診斷試劑。本試驗(yàn)為下一步以ASFV VP73蛋白作為抗原的診斷試劑的研制奠定了一定基礎(chǔ)。

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