曹聯(lián)飛 蘇曉玲 趙東緒 華啟云 胡福良

（1，浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，杭州 310021；2，金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，金華 321000；3，浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，杭州 310058）

浙江是中華蜜蜂（Apis cerana cerana，中蜂）的傳統(tǒng)飼養(yǎng)區(qū)，20世紀(jì)80年代調(diào)查約有10萬群[1]。然而隨著西方蜜蜂（Apis mellifera）的大量引進，浙江中蜂數(shù)量銳減。近幾年，中蜂養(yǎng)殖效益大幅提高，中蜂授粉也逐漸興起，浙江中蜂飼養(yǎng)數(shù)量逐漸增加。為了解種群數(shù)量波動造成的遺傳多樣性變化，本研究對浙江中蜂微衛(wèi)星遺傳多樣性進行了初步分析。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

浙江中蜂樣本采自浙江省杭州、金華、寧波、紹興、湖州、衢州、溫州、臺州、麗水、舟山等地區(qū)。其中金華3個采樣點，其它地區(qū)各1個采樣點。每個采樣點5群，共計60群。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA提取

取酒精浸泡保存的蜜蜂樣本，每群取1只，剪取蜜蜂胸部，按照細胞/組織基因組DNA提取試劑盒的說明和步驟提取總DNA。

1.2.2 微衛(wèi)星標(biāo)記的選擇

參考NCBI網(wǎng)站及Solignac等[2]報道的微衛(wèi)星信息，選用A14、A88、A76、A24和B124共5個微衛(wèi)星位點。反向引物使用FAM或者HEX熒光標(biāo)記。引物序列及PCR反應(yīng)退火溫度、Mg2+濃度見表1。

1.2.3 PCR擴增

PCR反應(yīng)體系為10μL，其中10×buffer 1μL，25mmol/L MgCl20.48~0.68μL，10mmol/L dNTP 1μL，10nmol/L引物各0.4μL，DNA模板1μL，Taq酶0.1μL，純水補齊。PCR反應(yīng)程序為：94℃ 4min；94℃ 0.5min，55~58℃ 0.5min，72℃0.5min，35個循環(huán)；72℃ 10min。

1.2.4 微衛(wèi)星檢測

各個微衛(wèi)星位點的PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司，由ABI 3730XL測序儀分析。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

使用GeneMarker軟件讀取微衛(wèi)星位點信息。

利用Microsatellite-Toolkit軟件[3]計算各微衛(wèi)星位點的等位基因數(shù)目、多態(tài)信息含量（PIC）、期望雜合度（He） 和觀察雜合度（Ho）。

2 結(jié)果與分析

浙江中蜂微衛(wèi)星遺傳多樣性指標(biāo)見表2。

表2 浙江中蜂微衛(wèi)星遺傳多樣性指標(biāo)

浙江中蜂在A14、A24、A76、A88、B124位點分別檢測到2、3、5、2、9個等位基因，共檢測到21個等位基因，平均每個微衛(wèi)星位點4.2個等位基因。B124位點的PIC最高，為高度多態(tài)位點；A24和A76位點PIC在0.25以上，為中度多態(tài)位點。He的變化趨勢與PIC一致，B124位點最高，A24和A76位點中等。

浙江中蜂平均期望雜合度為0.3179，平均多態(tài)信息含量為0.2835，平均觀察雜合度為0.2667。

3 討論

多態(tài)信息含量是衡量基因變異程度較好的指標(biāo)，當(dāng)PIC>0.5時，該座位為高度多態(tài)性座位；0.25

基因雜合度也稱為基因多樣度，一般認為它是衡量群體遺傳變異的一個最適參數(shù)。朱翔杰等[5]研究顯示福建中華蜜蜂大部分地區(qū)的平均期望雜合度為0.5171。吉挺等[6]研究顯示江蘇中華蜜蜂群體的平均期望雜合度為0.4424。本研究顯示浙江中華蜜蜂平均期望雜合度僅為0.3179，遠低于福建和江蘇中華蜜蜂。說明浙江中華蜜蜂的遺傳多樣性較低，有必要對其采取更有效的保護措施。然而本研究的樣本數(shù)量較少，還有待于進一步系統(tǒng)深入研究。

近年來，利用微衛(wèi)星標(biāo)記進行中華蜜蜂的遺傳多樣性研究逐漸增多，然而已有研究利用的均是西方蜜蜂中報道的微衛(wèi)星引物，某些引物在中華蜜蜂中多態(tài)信息含量較少，影響了研究結(jié)果的可靠性。因此，開發(fā)中華蜜蜂自身的微衛(wèi)星標(biāo)記及引物勢在必行。此外，在不同的研究中，微衛(wèi)星引物使用的統(tǒng)一性也有待解決，以便于未來有關(guān)數(shù)據(jù)的比較分析。

[1] 許少玉, 楊冠煌. 中蜂的分布和變異(三)—粵、閩、浙三省中蜂狀況[J]. 中國養(yǎng)蜂. 1982, 33(6): 13~14.

[2] Solignac M, Vautrin D, Loiseau A, et al. Five hundred and fifty microsatellite markers for the study of the honeybee(Apis mellifera L)genome[J]. Molecular Ecology Notes, 2003, 3: 307~311.

[3] Park SDE. Trypanotolerance in West African Cattle and the Population Genetic Effects of Selection[D]. University of Dublin,2001.

[4] Botstein D, White R, Skolnick M. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms[J].American Journal of Human Genetics, 1980, 32: 314~331.

[5] 朱翔杰, 周冰峰, 吳顯達, 等. 福建中華蜜蜂微衛(wèi)星標(biāo)記的遺傳多樣性分析[J]. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版). 2011, 40(7):407~411.

[6] 吉挺, 陳晶, 殷靈, 等. 江蘇省野生及家養(yǎng)中華蜜蜂微衛(wèi)星DNA遺傳多樣性分析[J]. 中國畜牧獸醫(yī). 2007, 34(12): 39~41.