羅照明 張紅城 （譯）

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京100093）

（接2013年《中國(guó)蜂業(yè)》上旬第1期）

不同地區(qū)蜂膠的290nm的HPLC色譜圖如圖2所示。來自于南美洲的蜂膠（A）和歐洲的蜂膠（C）的化學(xué)成分相近，而與大部分的巴西蜂膠差別明顯。歐洲蜂膠的特點(diǎn)是含有大量的酚酸 （表 2，峰 1－5，9，19，22a－24，31－34，36，43，44）和黃酮（ 表 2,峰 6－8，10－18，20－22，25－30，35，37－42）。很多的化學(xué)成分也出現(xiàn)在亞洲蜂膠（如中國(guó)）和阿根廷蜂膠。相比之下，巴西蜂膠有明顯的模式。在綠色蜂膠和Silvestre蜂膠中的阿替匹林C（峰53）、P-香豆酸的異戊二烯衍生物（峰56）及不同的咖啡酰奎尼酸（表2，峰45－48）是主要的成分，其中還含有少量的4-羥基-3-異戊二烯肉桂酸、異平基-P-香豆酸酯（峰50），山奈素（峰52），一個(gè)肉桂酸的衍生物（峰 54），一個(gè)色滿（chroman）衍生物（峰55）及一個(gè)香豆酮衍生物（峰57）。在巴西紅蜂膠里檢測(cè)出的少量的黃酮，有總含量少于0.2%的鷹嘴豆素A（Biochanin A）和芒柄黃花素（Formononetin），還有一些被Piccinelli等報(bào)道過的異黃酮。

蜂膠里大部分化合物是通過與標(biāo)準(zhǔn)品的色譜保留時(shí)間和紫外光譜對(duì)照來進(jìn)行確認(rèn)的。沒有標(biāo)準(zhǔn)品的未知成分，通過色譜聯(lián)合的紫外數(shù)據(jù)及質(zhì)譜進(jìn)行確認(rèn)。色譜法和紫外光譜能夠保證區(qū)分不同級(jí)別的多酚。事實(shí)上，在反相色譜的條件下，由于羥基化和甲基化的位置及數(shù)量不同，不同的黃酮被分離開來。羥基數(shù)量的增加會(huì)降低保留時(shí)間，而除了甲基在C5位置，甲基化數(shù)量的增加會(huì)增加保留時(shí)間。而且，烷酮醇（如短葉松素），黃酮（柯因），黃烷酮（如松屬素）比相應(yīng)的黃酮醇（如高良姜素）先洗脫出來。

考慮到紫外光譜特征，肉桂酸衍生物典型的最大紫外吸收峰在275～325nm范圍。相比之下，黃酮醇和黃酮最大的紫外吸收峰分別在265/358和268/310nm，這些容易區(qū)別，但是烷酮醇（UVmax290 nm）和黃烷酮（UVmax292 nm）不容易辨別。

分子離子峰及一些特殊的離子碎片作為進(jìn)一步確認(rèn)未知化合物參考的方法。MS/MS在陰離子模式和陽(yáng)離子模式進(jìn)行，因?yàn)槎喾踊衔锏拿恳唤M離子碎片不同。肉桂酸在陽(yáng)離子模式下產(chǎn)生離子峰[M－H2O]+，在陰離子模式下產(chǎn)生離子峰[M－COOH]－。然而，肉桂酸酯主要在陰離子模式下產(chǎn)生離子碎片。例如，咖啡酸芐酯（峰 23）產(chǎn)生離子峰[m/z]－179（caffeic acid）[m/z]－161（caffeic acid－H2O）and[m/z]－135（caffeic acid－COOH）。

如果黃酮醇，黃烷酮及黃酮在A環(huán)上沒有取代基，就會(huì)產(chǎn)生陰離子峰[m/z]－151和陽(yáng)離子峰[m/z]+153。不同的黃酮類都會(huì)有一個(gè)共同的離子峰[m/z]－151，它來源于A環(huán)的逆狄爾斯-阿爾德反應(yīng)。但是黃酮醇的離子峰不同，如短葉松素。它們產(chǎn)生一個(gè)離子峰[m/z]－253[M－H2O]－，H2O的缺失是因?yàn)镃環(huán)上C3位置存在羥基。類似的情況，5-甲氧基短葉松素乙酸酯（峰18）在低能量碰撞下產(chǎn)生離子峰[m/z]－285[M－acetate]－，[m/z]－267[M－acetate－H2O]－，[m/z]－253[M－acetate－H2O-CH3]－（圖3）。在高的碰撞能量下只產(chǎn)生離子峰[m/z]－253。相似分裂模式也存在于短葉松素的酯類，如短葉松素-3-丙酸酯（圖4，峰35）。峰8需要特別說明，因?yàn)樗淖贤夤庾V特征表明其為槲皮素的衍生物，分子離子峰[m/z]－315也說明其為一個(gè)甲氧基槲皮素。這個(gè)甲氧基的位置不可能在B環(huán)上的C3'，事實(shí)上，3'-甲氧基槲皮素就是異鼠李素，它的保留時(shí)間與峰8不同。另一方面甲氧基不能在A環(huán)，因?yàn)镸S/MS產(chǎn)生一個(gè)離子峰[m/z]－151，從而排除了甲氧基的這個(gè)位置。因此，峰8只能為3-甲氧基槲皮素（甲氧基位于C環(huán)C3位置），基于紫外光譜特征，結(jié)合分子離子峰[m/z]－299，離子碎片[m/z]－255[M－COOH]－和[m/z]+245[M－CH2COOH]+，峰53可以鑒定為阿替匹林C。通過對(duì)紫外光譜特征（典型的P-香豆酸衍生物）及離子碎片[m/z]－187[M－COOH]－和 [m/z]+215[M－H2O]+分析，可以認(rèn)為峰50是異平基結(jié)合到P-香豆酸的一個(gè)化合物。

3.4 蜂膠中黃酮和酚酸的含量

不同地區(qū)來源的不同蜂膠樣品中的總黃酮和總酚酸含量匯總?cè)绫?。通過可以得到的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線來測(cè)定黃酮和酚酸的含量。短葉松素及其酯類用短葉松素標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，它們的含量通過分子量比例來?yè)Q算。按類似的方法，咖啡酸和P-香豆酸的酯類含量分別用咖啡酸和P-香豆酸標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定。除了巴西蜂膠的黃酮含量很低之外，大部分地區(qū)黃酮含量較高，如柯因 （2～4%），松屬素（2～4%），短葉松素乙酸酯 （1.6～3%）及高良姜素 （1～2%）。單從黃酮含量考慮，黃酮含量低于11%的蜂膠可以認(rèn)為是次品的；黃酮

含量介于11～14%之間的為可以接受的，黃酮含量介于14～17%，及大于17%可分別認(rèn)為是好的及高質(zhì)量的。另一方面，肉桂酸衍生物（如P-香豆酸酯及CAPE）對(duì)人的身體健康有著顯著的積極的影響；因此，對(duì)于它們的定性和定量具有重要的意義。

表2 不同來源的蜂膠樣品中分離鑒定的化合物及其RT，UV，MS和MS/MS特征

表3 不同地區(qū)蜂膠的總黃酮和酚酸的含量（g/100g）

4 總結(jié)

不同地區(qū)的蜂膠含有不同的化學(xué)成分，陰離子模式下的LC-DAD-MS方法是鑒別和篩選蜂膠的有效的指紋識(shí)別方法。而且，結(jié)合MS和碰撞產(chǎn)生的碎片離子（CID-Ms2）可用于結(jié)構(gòu)的鑒定，特別是沒有標(biāo)準(zhǔn)品的化合物。盡管多酚代表著大多數(shù)蜂膠的成分，但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃酮類物質(zhì)可作為評(píng)價(jià)蜂膠質(zhì)量的參考物。

考慮到巴西蜂膠含有的黃酮很少，酚酸類（如artepillin C）可以用于評(píng)價(jià)其蜂膠的質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)方法可以考慮應(yīng)用于蜂膠原料及其作為不同商業(yè)用途的篩選。