郭運玲 尹奇 孔華 黃啟星 左嬌 賀立卡 郭安平

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術研究所 農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學與遺傳資源利用重點實驗室，?？?571101）

木薯（Manihot esculantaCrantz）屬大戟科（Euphorbiacae）木薯屬（Manihot），為多年生灌木，是世界三大薯類作物之一。全球種植面積1 700余萬hm2，僅次于馬鈴薯，大于甘薯，廣泛分布于南、北緯30之間，不僅為全球超過5億人提供基本的食物，而且是熱帶、亞熱帶重要的熱能來源［1］。由于木薯是雜合體，遺傳背景復雜，采用常規(guī)育種的方法改良品種和提高產(chǎn)量很難達到預期的效果。生物技術作為一種強有力的工具，能有效地彌補傳統(tǒng)育種方法的不足，打破物種間的界限，在不改變作物原有特性的基礎上，能將一些具有重要農(nóng)藝性狀的基因（如抗病、耐寒以及與產(chǎn)量、品質(zhì)相關基因等）導入其中，從而實現(xiàn)品種改良的目的。但是，許多植物的遺傳轉(zhuǎn)化研究中存在的再生困難問題嚴重制約了轉(zhuǎn)基因技術的廣泛應用［2］。因此如何提高轉(zhuǎn)化效率是木薯及其他作物遺傳轉(zhuǎn)化中的一個關鍵問題。

硝酸銀曾作為一種殺菌劑，應用于植物組織培養(yǎng)的表面消毒［3］。近年來，在植物組織培養(yǎng)中，添加硝酸銀可以促進愈傷組織及芽器官發(fā)生、體細胞胚胎的形成以及離體植株的再生，這在許多單子葉、雙子葉植物中已有研究［4］。有研究者將硝酸銀應用于植物遺傳轉(zhuǎn)化上，以提高外源基因的轉(zhuǎn)化效率。例如，在水稻［5］、黑麥草［6］、油菜［7］，香蕉［3］，大豆［8］、桑樹［9］等作物的轉(zhuǎn)化研究中用到硝酸銀，結(jié)果顯示硝酸銀在這些作物的遺傳轉(zhuǎn)化中具有促進作用。張鵬和姚慶榮［10，11］也對幾個木薯品種的器官發(fā)生和植株形成進行過研究，發(fā)現(xiàn)硝酸銀有促進芽器官的發(fā)生和抑制愈傷的形成。但是到目前為止，還沒有關于硝酸銀對木薯子葉經(jīng)農(nóng)桿菌處理后對不定芽誘導影響的報道。本研究以目前生產(chǎn)上的主栽木薯品種華南8號（SC8）胚狀體子葉為外植體，比較硝酸銀對經(jīng)農(nóng)桿菌侵染和未經(jīng)農(nóng)桿菌侵染的外植體的不定芽誘導的影響，研究硝酸銀在農(nóng)桿菌介導的木薯遺傳轉(zhuǎn)化中的作用，旨在為建立高效的木薯遺傳轉(zhuǎn)化體系打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為SC8，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院品種資源研究所提供，本實驗室試管苗保存。以成熟培養(yǎng)10-15 d的初生或次生胚狀體子葉作為外植體。

1.2 方法

1.2.1 農(nóng)桿菌工程菌株及菌液的制備 農(nóng)桿菌工程菌株GV3101，內(nèi)含質(zhì)粒pRNAiSIII（本實驗室構(gòu)建保存）。挑取保存的農(nóng)桿菌單菌落接種于25 mL含相應抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中，28℃，200 r/min培養(yǎng)24-36 h至對數(shù)生長期，將培養(yǎng)好的菌液在5 000 r/min，常溫下離心10 min，收集菌體重懸于MS液體培養(yǎng)基中，使其菌液濃度達到OD=0.5-1.0備用。

1.2.2 培養(yǎng)基配置 不定芽誘導培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基上添加1 mg/L 6BA，0.5 mg/L CuSO4，2%蔗糖和6 g/L瓊脂粉，pH5.8。根據(jù)試驗需要添加不同濃度的硝酸銀（0、2、4、6、8和 10 mg/L 6個處理）。

1.2.3 未經(jīng)農(nóng)桿菌處理的硝酸銀作用試驗 將準備好的SC8胚狀體子葉接種在含不同濃度硝酸銀的不定芽誘導培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為28℃，光照12-14 h/d，光照強度1 500-2 000 Lx。7 d繼代一次，每皿接種50個外植體，每個處理接種3皿，重復2次。20 d后統(tǒng)計愈傷組織和不定芽生長情況。

1.2.4 經(jīng)農(nóng)桿菌處理后硝酸銀的作用試驗 將準備好的SC8胚狀體子葉放入制備好的農(nóng)桿菌工程菌液中侵染30-45 min，倒掉菌液，并將外植體上多余菌液吸干，接種到不加Kan的不定芽誘導培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3 d。然后將外植體上的菌體用無菌水沖洗2-3次，最后一次加入適量羧芐青霉素，直到將菌體全部洗凈，用無菌濾紙將外植體上多余水分吸干。接種到加有Kan抗性篩選和不同濃度硝酸銀的不定芽誘導培養(yǎng)基上。7 d繼代一次。每皿接種50個外植體，每處理接種3皿，重復2次。20 d后統(tǒng)計愈傷組織和不定芽生長情況。

1.2.5 硝酸銀處理時間對不定芽的影響試驗 硝酸銀添加的時間設置兩個處理（A、B），A處理為20 d，即外植體在添加有硝酸銀的不定芽誘導培養(yǎng)基上生長20 d后，其他培養(yǎng)條件不變，將外植體轉(zhuǎn)接到去除硝酸銀的不定芽誘導培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)7 d。B處理是在不定芽的誘導生長整個過程中都添加硝酸銀。

1.2.6 外植體上不定芽和愈傷組織的統(tǒng)計方法 參考Zhang［10］2001年的方法并稍作修改。

不定芽的發(fā)生率分3個級別統(tǒng)計，分別用OD1（organogenesis degree）、OD2、OD3表示。OD1每個外植體上不定芽的分化為3個以下植株所占的百分比；OD2每個外植體上不定芽的分化為 3-5個植株所占的百分比；OD3 每個外植體上不定芽分化 5個以上植株所占的百分比；它們之和為每個處理的不定芽發(fā)生率SO（shoot organogenesis）。

愈傷組織的發(fā)生率也分3個級別統(tǒng)計，分別用CD1（callus degree）、CD2、CD3表示。CD1每個外植體上愈傷組織直徑小于0.25 cm植株所占的百分比；CD2每個外植體上愈傷組織直徑在0.25-0.5 cm植株所占的百分比；CD3愈傷組織直徑大于0.5 cm植株所占的百分比，它們之和為每個處理的愈傷組織發(fā)生率CF（callus formation）。

2 結(jié)果

2.1 硝酸銀對未經(jīng)農(nóng)桿菌處理的木薯子葉愈傷及不定芽誘導的影響

由表1和表2及圖1可知，未經(jīng)農(nóng)桿菌處理的木薯SC8胚狀體的子葉，由于硝酸銀濃度的不同，對外植體不定芽發(fā)生的影響不同。我們觀察到在不加硝酸銀的不定芽誘導培養(yǎng)基中，子葉切口處產(chǎn)生了大量黃色致密的愈傷組織，愈傷組織形成率達到100%；不定芽發(fā)生率較低，為 58.5%，主要以單芽分化為主。隨著硝酸銀濃度的增加，不定芽發(fā)生隨之增加，愈傷組織形成減少，當濃度為6 mg/L時，不定芽發(fā)生率達到最高，為 87.5%，每個外植體上的不定芽數(shù)目也相應增加，有些甚至達到6-7個。研究表明，添加適宜濃度的AgNO3，不僅可以大大提高不定芽的發(fā)生，而且可以明顯降低愈傷組織的形成。我們還可以看出，在不同濃度的硝酸銀處理中，愈傷組織形成隨AgNO3濃度的升高而降低，當AgNO3濃度達到6 mg/L時，子葉切口周圍產(chǎn)生的愈傷較少；當濃度大于6 mg/L，達到8和10 mg/L時，愈傷組織受到明顯抑制，幾乎沒有愈傷形成，但不定芽發(fā)生也未因此而升高，相反呈下降趨勢。因此，對木薯SC8而言，在不定芽誘導培養(yǎng)基中，添加6 mg/L硝酸銀，即可獲得最佳的不定芽誘導效果。

表1 不同濃度的硝酸銀對未經(jīng)農(nóng)桿菌處理外植體不定芽分化的影響

表2 不同濃度的硝酸銀對經(jīng)農(nóng)桿菌處理外植體愈傷組織形成的影響

圖1 硝酸銀對未經(jīng)農(nóng)桿菌處理的SC8外植體不定芽誘導和愈傷組織形成的影響

2.2 硝酸銀對經(jīng)農(nóng)桿菌處理的木薯子葉愈傷及不定芽誘導的影響

由表3、表4和圖2可以看出，經(jīng)農(nóng)桿菌處理后的木薯SC8胚狀體子葉，我們觀察到在不加硝酸銀的不定芽誘導培養(yǎng)基中，每個子葉切口處都有淡黃色愈傷組織的形成，愈傷組織大有多；不定芽發(fā)生少，外植體上基本以單個芽分化為主。隨著硝酸銀濃度的增加，不定芽發(fā)生隨之增加，而愈傷組織反而減少。這與未經(jīng)農(nóng)桿菌處理的研究結(jié)果大體一致。只是硝酸銀的濃度為8 mg/L時，不定芽發(fā)生率達到最高，為85.3%，每個外植體上的不定芽數(shù)目也有所增加，多的可達5個以上。當硝酸銀濃度達到10 mg/L，愈傷組織基本很少，但不定芽的分化反而銳減，說明硝酸銀的濃度并非越高越好，對木薯SC8而言，經(jīng)農(nóng)桿菌侵染后外植體不定芽的分化以添加硝酸銀濃度8 mg/L為適宜。

表3 不同濃度的硝酸銀對經(jīng)農(nóng)桿菌處理的外植體不定芽分化的影響

表4 不同濃度的硝酸銀對經(jīng)農(nóng)桿菌處理后外植體愈傷組織形成的影響

圖2 硝酸銀對經(jīng)農(nóng)桿菌處理的SC8外植體不定芽誘導和愈傷組織形成的影響

2.3 硝酸銀的處理時間對愈傷及不定芽的影響

圖3 硝酸銀處理時間對不定芽的影響

從圖3可以看出，處理A（20 d）誘導出來的不定芽生長正常，處理B（全程）誘導出來的不定芽生長不正常，芽發(fā)生畸形變異。所以，硝酸銀作為不定芽的促進劑不能長時間添加，添加的時間太長，不但對芽的誘導沒有促進作用，反而使誘導出的芽發(fā)生畸形變異。硝酸銀對木薯SC8子葉不定芽誘導的處理時間以20 d比較適宜。

3 討論

AgNO3作為乙烯合成抑制劑，可有效降低植物細胞在離體培養(yǎng)中乙烯的積累，從而促進外植體的生長和不定芽分化。在植物離體培養(yǎng)時，培養(yǎng)基中添加AgNO3，可以明顯促進器官發(fā)生、體細胞胚胎形成和完整植株的再生。在許多單子葉和雙子葉作物上得到證明和應用［12-15］。

許多研究在建立植物遺傳轉(zhuǎn)化技術體系時都對培養(yǎng)基上添加硝酸銀的最適濃度進行篩選［10，11］，但是這種篩選一般是在外植體未被農(nóng)桿菌處理的情況下進行的，當外植體被農(nóng)桿菌處理后受到的脅迫增加，外植體內(nèi)的乙烯含量從理論上來說也會相應增加，那么在后期的篩選培養(yǎng)基上所加硝酸銀濃度是否會隨之發(fā)生變化，而且硝酸銀對農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化到底有無影響，這一問題往往被忽視。本研究從該問題著手，比較研究了硝酸銀對未經(jīng)農(nóng)桿菌處理和經(jīng)農(nóng)桿菌處理后的木薯子葉不定芽誘導的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)硝酸銀對二者的影響基本一致，只是經(jīng)農(nóng)桿菌侵染后所需硝酸銀的最適濃度為8 mg/L，高于未經(jīng)農(nóng)桿菌處理的芽誘導所需硝酸銀最適濃度6 mg/L。這可能與外植體所受的脅迫不同有關，經(jīng)農(nóng)桿菌處理過的外植體所受脅迫不但有機械損傷，還有農(nóng)桿菌的侵染、篩選抗性標記卡納霉素和抑菌劑羧芐青霉素的影響，需要更多的銀離子來抑制乙烯的作用。

硝酸銀添加的濃度、方式及時間，從其他作物的研究結(jié)果來看，硝酸銀使用的濃度一般是1-10 mg/L。濃度太高，對外植體會產(chǎn)生毒性作用［4］。同時應注意適宜的AgNO3濃度，外植體長期培養(yǎng)于含AgNO3的培養(yǎng)基中也易導致再生植物畸形而影響再生率。Palmer［16］將培養(yǎng)12 d的外植體轉(zhuǎn)接到不含硝酸銀的培養(yǎng)基上，能促進不定芽的數(shù)目。Sharma等［17］認為，培養(yǎng)物最少應在含硝酸銀的再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)11 d，張鵬［12，13］認為硝酸銀使用時間長短跟芽原基的形成時間有關，一般在芽原基形成后即可去除硝酸銀，不同植物不同品種對硝酸銀的反應不同。與前人研究結(jié)果相同，木薯SC8子葉芽的誘導和形成不能在添加硝酸銀的培養(yǎng)基上長期生長，以在添加硝酸銀芽誘導培養(yǎng)基上生長20 d較適宜，這時能有效促進芽的分化和生長。若時間過長，對不定芽的形成沒有促進作用，反而會使已形成的芽發(fā)生畸形變異而影響再生率。

4 結(jié)論

本研究以成熟培養(yǎng)10-15 d華南木薯SC8品種的胚狀體子葉為外植體，研究硝酸銀在根癌農(nóng)桿菌介導的木薯遺傳轉(zhuǎn)化。結(jié)果表明，硝酸銀對木薯SC8胚狀體子葉愈傷形成有明顯抑制作用，對其遺傳轉(zhuǎn)化有促進作用。

［1］ 黃毓文, 劉殷勤.國際熱帶農(nóng)業(yè)中心的木薯研究［J］.熱帶亞熱帶植物學報, 1995, 3（2）：93-100.

［2］ 趙巧陽, 賴鐘雄.硝酸銀在離體培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化中的作用及其機理［J］.亞熱帶農(nóng)業(yè)研究, 2008, 4（1）：62-66.

［3］ 黃玉吉, 賴鐘雄, 趙巧陽.硝酸銀在香蕉遺傳轉(zhuǎn)化上的作用［J］.亞熱帶農(nóng)業(yè)研究, 2008, 4（1）：59-62.

［4］ 劉娟, 湯浩茹, 王小蓉, 羅婭.硝酸銀在植物離體培養(yǎng)中的應用之研究進展［J］.農(nóng)業(yè)生物技術科學, 2007, 3（10）：400-407.

［5］ 王亞琴, 梁承鄴.硝酸銀在水稻農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化中的作用［J］.湖南大學學報：自然科學版, 2004, 31（2）：28-34.

［6］ 喬定君, 毛萍, 馬欣榮, 楊宏.甘露醇及AgN03對根癌農(nóng)桿菌介導的多年生黑麥草遺傳轉(zhuǎn)化的影響［J］.草業(yè)學報, 2011,20（1）：102-110.

［7］ 高武軍, 王景雪, 盧龍斗, 等.硝酸銀在油菜基因轉(zhuǎn)化中的影響作用［J］.中國農(nóng)學通報, 2002, 18（4）：43-47.

［8］ 劉金華, 王丕武, 武麗敏, 等.脯氨酸、硝酸銀對農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化大豆的影響［J］.大豆科學, 2003, 22（1）：36-39.

［9］ 鐘名其, 樓程富, 談建中, 等.硝黢銀對桑樹遺傳轉(zhuǎn)化作用［J］.熱帶亞熱帶植物學報, 2002, 10（1）：74-76.

［10］ Zhang P, Phansiri S, Puonti-Kaerlas J. Improvement of cassava shoot organogenesis by the use of silver nitratein vitro［J］. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 2001, 67：47-54.

［11］ 姚慶榮, 郭運玲, 孔華, 等.影響木薯芽器官發(fā)生及植株再生的因素［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學, 2010, 38（30）：16781-16783.

［12］ 張鵬, 傅愛根, 王愛國. AgNO3 在植物離體培養(yǎng)中的作用及可能的機制［J］.植物生理通訊, 1997, 33（5）：376-379.

［13］ 張鵬, 凌定厚.提高菜心離體植株再生頻率的研究［J］.植物學報, 1995, 3（11）：902-908.

［14］ 王文星, 屈山, 曹成有, 等.硝酸銀對離體培養(yǎng)煙草葉片愈傷組織形成和芽再生及其脯氨酸和丙二醛含量的影響［J］.植物生理學通訊, 2006, 42（4）：668-670.

［15］ 杜虹, 莊東紅, 黃文華. AgNO3 對大白菜子葉芽再生的促進作用［J］.熱帶亞熱帶植物學報, 2000, 8（2）：109-112.

［16］ Palmer EE. Enhanced shoot regeneration fromBrassica campestrusby silver nitrate［J］. Plant Cell Rep, 1992, 11：541.

［17］ Sharma KK. Bhojwani SS. et al. Factors affecting high frequency differentiation of shoots and roots from cotyledon explants ofBrassica jancea（L.）czern［J］. Plant Sci, 1990, 66（2）：247-253.