王建文，陳華紅*，段亞霞，楊彝華

(1.楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系，云南 楚雄 675000;2.楚雄州林業(yè)科學(xué)研究所，云南 楚雄 675000)

核桃 (Juglans regia L.)是核桃屬植物中分布最廣、經(jīng)濟(jì)價(jià)值最高的栽培種［1］。自古以來，核桃的保健功能就為人們所認(rèn)識和推崇，《本草綱目》中也有補(bǔ)氣養(yǎng)血、潤燥化炎、益命門、利三焦、溫肺潤腸等功能的記載［2］。核桃在云南楚雄的栽培歷史悠久，是主要經(jīng)濟(jì)作物。但是在核桃種植過程中會出現(xiàn)多種疾病如炭疽病、黑斑病、白粉病、枝枯病、腐爛病、黃化病、灰斑病、核桃花葉病、木腐病、種仁霉?fàn)€病和頂端壞死病等［3—7］。資料顯示擬盤多毛孢 (Pestalotiopsis)和鏈格孢 (Alternaria)會引起核桃組織的多種病害［7］。而使用農(nóng)藥防治核桃病害，殘留的農(nóng)藥會危害人類健康，由此人們迫切需要尋找更為高效、環(huán)保的防治方法。

植物內(nèi)生真菌 (Plant endophytic fungi)是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物各種組織器官內(nèi)部的真菌，被感染的宿主植物 (至少是暫時(shí))不表現(xiàn)出外在癥狀，可通過組織學(xué)方法或從嚴(yán)格表面消毒的植物組織中分離或從植物組織內(nèi)直接擴(kuò)增出微生物DNA的方法來證明其內(nèi)生［8］。內(nèi)生真菌長期生活在植物體內(nèi)的特殊環(huán)境中，并與宿主協(xié)同進(jìn)化。一方面植物體為其提供生長必需的營養(yǎng)和能量;另一方面，內(nèi)生真菌又可通過自身的代謝產(chǎn)物或借助于信號傳導(dǎo)作用對植物體產(chǎn)生影響［9］。

許多植物體內(nèi)都存在著特殊的內(nèi)生真菌，它們在植物體內(nèi)作為生防菌，能有效地防治植物病害，增強(qiáng)植物對病原菌的抗性。近幾年，人們在植物內(nèi)生真菌防治植物病害方面進(jìn)行了大量的研究［10］。植物內(nèi)生真菌的生防機(jī)制是其分泌抗菌物質(zhì)、與病菌競爭生態(tài)位和營養(yǎng)物質(zhì)、誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性、產(chǎn)生植物激素等。但其作為植物病害生防因子進(jìn)行開發(fā)與應(yīng)用中還存在一些問題［10］。翟梅枝等人研究表明，核桃和黑核桃的內(nèi)生真菌有廣泛的抗菌譜，對棉花立枯病菌、蘋果炭疽病菌、梨黑星病菌、小麥赤霉病菌和油菜菌核病菌菌絲生長具有抑制作用［11］。

近年來，植物病害的生物防治研究越來越受到人們的重視。從植物內(nèi)生菌尋找具有拮抗活性的生物活性物質(zhì)物質(zhì)，成為無公害生物性農(nóng)藥創(chuàng)制的一條途徑［11］。對楚雄地區(qū)核桃內(nèi)生真菌進(jìn)行分離、純化以及抗菌活性研究，可為篩選防治核桃病害的活性菌株提供優(yōu)良的種質(zhì)資源。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

取自楚雄州楚雄市，牟定縣等地不同品種的生長良好的核桃樹的根、莖、葉，選取無病斑，無蟲害的健康核桃組織作為實(shí)驗(yàn)材料.

1.2 培養(yǎng)基

內(nèi)生菌分離培養(yǎng)基:TWYE培養(yǎng)基 (yeast extract 0.25g，KH2PO40.5 g，Taping Water 1L，agar 15g，pH自然)，琥珀酸鈉培養(yǎng)基 (sodium succinate 2g，KH2PO40.3 g，Mg-SO4.7H2O 0.1 g，CaCO31g，F(xiàn)eSO4.7H2O 0.01g，agar 15g，ddH2O 1L，pH7.2)，蘋果酸鈉培養(yǎng)基 (蘋果酸鈉0.6g，MgSO4.7H2O 0.2 g，F(xiàn)eSO4.7H2O 0.01g，CaCO30.6g，KH2PO40.3 g，KNO30.5g，agar 15g，ddH2O 1L，pH7.2)。

分離菌株純化、活化培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基 (馬鈴薯200g、蔗糖20g、瓊脂15～20g、PH自然、水1000ml)。

發(fā)酵培養(yǎng)基:大豆粉 20g，蛋白胨 2g，葡萄糖 20g，淀粉 5g，酵母膏 2g，NaCl 4g，K2HPO40.5g，MgSO4.7H2O 0.5g，CaCO32g，ddH2O 1L，pH7.8

促孢培養(yǎng)基:KH2PO42g，KNO31g，MgSO40.5g，淀粉0.2g，葡萄糖0.2g，蔗糖0.2g，瓊脂20g，水1L，pH自然。

1.3 指示菌

擬盤多毛孢 (Pestalotiopsis spp.)、鏈格孢 (Alternaria spp.)、德氏孺孢 (Drechslera spp.)、灰葡萄孢 (Botrytis cinerea)和疫霉 (Phytophthora spp.)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 內(nèi)生菌的分離

核桃樣品用自來水沖洗干凈后，進(jìn)行表面消毒 (程序:0.01%Tween 20浸泡1 min→70%乙醇溶液處理2 min→無菌去離子水洗4—5次→有效氯含量為5%的次氯酸鈉浸泡5 min→硫代硫酸鈉溶液浸泡10 min→無菌去離子水洗4—5次。)取0.5 mL最后一遍清洗植物樣品的水涂布于TSA固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)1周，檢測表面消毒效果。

將表面消毒的植物組織打碎，均勻接種于分離培養(yǎng)基中，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1至3周，待長出菌絲后挑取，使用PDA培養(yǎng)基進(jìn)行純化，純化的菌株使用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)及保存。

2.2 核桃內(nèi)生真菌的鑒定

使用插片法觀察真菌形態(tài)特征，即將純化的菌株接種到促孢培養(yǎng)基，28℃下恒溫培養(yǎng)4周后，顯微觀察菌絲形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)特征及孢子形態(tài)，參照文獻(xiàn)進(jìn)行菌株的鑒定［12］。

2.3 核桃內(nèi)生真菌的發(fā)酵

將內(nèi)生真菌菌株接種于PDA平板活化后，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28℃，使用搖床(120rpm/min)培養(yǎng)7d，發(fā)酵液用乙酸乙酯浸提48小時(shí)后，高速離心，取上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，加入無菌水制成發(fā)酵樣品。

2.4 指示菌的活化及培養(yǎng)

將擬盤多毛孢、鏈格孢、德氏孺孢、灰葡萄孢和疫霉5種指示菌菌株接種于PDA固體培養(yǎng)基上恒溫培養(yǎng)4～6天，活化用于抑菌實(shí)驗(yàn)。

活化好的病原菌接種于PDA液體培養(yǎng)基，在28℃，搖床 (120r/min)培養(yǎng)至對數(shù)生長期。

2.5 抑菌實(shí)驗(yàn)

取200μl菌液加入PDA培養(yǎng)基制成含菌平板，采用濾紙片法進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，28℃恒溫培養(yǎng)48h后，測量抑菌圈的直徑大小，以兩性霉素溶液40g/mL為陽性對照。

3 結(jié)果與討論

共分離得到具不同形態(tài)特征的核桃內(nèi)生真菌22株，其中從葉片分離得到的內(nèi)生真菌數(shù)量最多，為10株，占分離菌株總數(shù)的45.5%，從根分離得到8株，占36.4%，從莖分離得到4株，占18.2%。因此，楚雄核桃的內(nèi)生真菌在不同部位的分布數(shù)量為根＞葉＞莖，主要分布于根和葉中。

表1 核桃內(nèi)生真菌中對五種指示菌的抑菌效果Table 1 Antifungus activity of endophytic fungus

22個核桃內(nèi)生真菌分離菌株分屬于6個屬，其中瓶霉屬 (Phialophora)有2株，占分離菌株總數(shù)的9.1%;明枝霉屬 (Hyalodendron)有1株，占4.5%，單襄霉屬 ()有1株，占 4.5%;青霉屬 (Penicillium)有 10株，占總量的 45.5%;擬青霉屬(Paecilomyces)有2株，占總量的9.4%;鐮孢屬 (Fusarium)有6株，占總量的27.3%。由此可知22株核桃內(nèi)生真菌中青霉屬菌株占優(yōu)勢，其次是鐮孢屬，明枝霉屬和單襄霉屬最少。從根分離得到的8個菌株分屬瓶霉屬，明枝霉屬，單襄霉屬和鐮孢屬4個屬，從莖分離得到的有擬青霉屬和鐮孢屬的菌株，從葉中分離得到的10個菌株則屬于單襄霉屬和青霉屬。因此雖然從葉中分離得到的菌株數(shù)量最多，但種群組成相對較為單一，從核桃根分離得到的內(nèi)生真菌較為多樣。根據(jù)李曉紅等的研究，核桃內(nèi)生真菌菌株分布于鐮孢屬、鏈格孢屬、殼滿孢屬 (Plenodomus)、葡萄孢屬 (Botrytideae)、大莖點(diǎn)霉屬(Phomopsis)和炭疽菌屬 (Colletotrichum)六個屬［13］，本研究分離得到的內(nèi)生真菌雖然也分布于6個屬，但僅有鐮孢屬與之相同;高智輝等分離得到的核桃內(nèi)生真菌分布于半知菌亞門的21個屬［14］，與本研究分離結(jié)果差異較大。這可能是由于環(huán)境因子 (土壤、溫度、水分等)對植物內(nèi)生菌的種群組成影響較大，各個研究所采集的核桃樣品產(chǎn)地不同，以及實(shí)驗(yàn)所采用的分離方法不同有關(guān)。

22株核桃內(nèi)生真菌菌株中有8株有抑菌活性，約占分離菌株數(shù)的36.4%。8株有抑菌活性的真菌分屬于鐮孢屬 (3株)、瓶霉屬 (2株)、青霉屬 (2株)和明枝霉屬 (1株)。由表1可知，對4種供試菌株有抑菌作用的有1株，占總量的4.5%;對3種病原菌有抑菌作用的有1株，占總量的4.5%;對兩種供試菌株有抑菌作用的有2株，占抑菌菌株總量的9%;菌株對一種供試菌株有抑菌作用的有4株，占總量的18.2%。菌株CX13，對鏈格孢和疫霉菌株均有很強(qiáng)抑制活性，對德氏孺孢和擬盤多毛孢也有一定抑制作用。菌株CX07對鏈格孢菌株有很強(qiáng)抑制活性。

德氏孺孢 (Drechslera spp.)能引起許多植物病害如離孺孢葉枯病、彎孢霉葉枯病、德氏霉葉枯病、葉斑病等［15］。8株具抑菌活性的真菌菌株中，對德氏儒孢有抑菌作用的有2株，其中分離自核桃葉的CX13對德氏孺孢的生長具有較好的抑制作用。

鏈格孢屬 (Alternaria spp.)真菌為世界性分布，主要引起核桃的頂端壞死病、褐斑病和黑斑病等［16］，是核桃主要的病原菌。針對這些病害采取了多種防治方法，從核桃內(nèi)生組織中分離出的CX07，CX09，CX13，和CX17菌株對鏈格孢的生長均具有抑制作用，其中，分離菌株CX07和CX13的抑菌活性較強(qiáng)，可進(jìn)一步研究，應(yīng)用于鏈格孢屬菌株引起的植物病害的生物防治。

疫霉屬 (Phytophthora spp.)大多寄生，誘發(fā)許多植物病害，但該病菌生理分化明顯、遺傳變異迅速，現(xiàn)有措施難以完全有效控制該病。致病疫霉主要引起馬鈴薯和番茄的晚疫病;馬鈴薯腐爛病、柑橘腐爛病;大豆根腐病等病癥［17—18］。CX02，CX03，CX09和CX13菌株均可抑制疫霉的生長，其中，CX13的抑菌效果較為明顯，可作為研發(fā)安全高效的微生物農(nóng)藥的菌種資源。

擬盤多毛孢 (Pestalotiopsis spp.)長期以來一直被當(dāng)作植物病原真菌來研究，如枯斑擬盤多毛孢是松樹的病原菌;污斑擬盤多毛孢在一些地方的山茶植物上是寄生性病原真菌［19］。擬盤多毛孢屬在大理州對核桃的葉、花、枝和果產(chǎn)生嚴(yán)重危害，影響核桃生長和產(chǎn)量［4］。對擬盤多毛孢引起的植物病害的防治仍采用傳統(tǒng)的防治方法，5個分離菌株CX7，CX8，CX9，CX13和CX17均對擬盤多毛孢菌株有一定抑制作用，這可為利用核桃內(nèi)生真菌來防治核桃病害提供豐富的菌種資源。

但所有測試菌株都對能引起蔬菜、瓜果、花卉等作物的灰霉病、腐爛病和霉?fàn)€病的灰葡萄孢菌 (Botrytis cinerea)無抑制活性。

結(jié)果表明青霉屬的cx13對四種供試菌具有明顯的抑菌效果，鐮孢屬的cx09號菌株對三種供試菌有一定的抑菌作用。8株具抑菌作用的核桃內(nèi)生真菌中有四株 (青霉屬2株、鐮孢屬2株)對鏈格孢有抑菌作用，且抑菌效果較明顯。

本研究表明，植物內(nèi)生真菌對多種引起植物病害的常見植物病原菌具有抑制作用，可為安全高效的生物農(nóng)藥和菌肥的開發(fā)提供豐富的微生物資源，在植物病害的生物防治方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

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