王鵬飛，謝昌賢，劉運添，李蘭枝，郝新樂，陳有君

(1.內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010021;2.金河生物科技股份有限公司，內(nèi)蒙古呼和浩特010200;3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018)

金霉素是一種四環(huán)類抗生素，生產(chǎn)上從金色鏈霉菌的代謝產(chǎn)物中分離得到。目前生產(chǎn)用菌株產(chǎn)金霉素的效價較低，是影響生產(chǎn)效益的重要因素。金色鏈霉菌產(chǎn)生四環(huán)類抗生素及其衍生物的特征受其遺傳基因控制，如果通過改變其遺傳特性，提高生產(chǎn)效能將會帶來很好的經(jīng)濟與社會效益。變異性普遍存在，遺傳因子發(fā)生改變，產(chǎn)生可以遺傳的新的性狀［1］。Stryzhkova HM等［2］用紫外線與nitrosoguanidine復(fù)合處理金色鏈霉菌獲得抗菌活性高出30%～35%的突變株。袁琳［3］用氯化鋰與紫外線復(fù)合處理金色鏈霉菌獲得活性提高12.3%～37%的四環(huán)素產(chǎn)生菌變株。陳梁軍［4］用60Co-γ射線照射(劑量為30Gy)處理金色鏈霉菌(Streptomcesaureofaciens)得到1株去甲金霉素突變株，其搖瓶效價較出發(fā)菌株提高32%。陳紅等［5］用微波處理金色鏈霉菌得突變菌株產(chǎn)四環(huán)類抗生素的效價高于對照10.5%左右。陳梁軍［6］經(jīng)紫外線(25 317 nm、30 W、距離20 cm、60 s)照射、金霉素耐受等處理金色鏈霉菌，得到1株金霉素突變株，其搖瓶效價較出發(fā)菌株提高18%。紫外線能引起DNA的改變而導(dǎo)致變異，氯化鋰單獨處理無效［7］，但與紫外線復(fù)合處理后，可以提高誘變效率。因而通過氯化鋰、紫外線復(fù)合處理，研究了金色鏈霉菌產(chǎn)金霉素特性的誘變特性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 出發(fā)菌株金色鏈霉菌，菌株34-55#。

1.1.2 培養(yǎng)基①平板培養(yǎng)基(質(zhì)量分數(shù)%，120℃滅菌30 min。下同):小麥面粉2.0，酵母0.1，硫酸鎂0.005，磷酸二氫鉀0.01，磷酸氫二銨0.015，瓊脂2.0;②斜面培養(yǎng)基:麩皮3.2，硫酸鎂0.005，磷酸二氫鉀0.01，磷酸氫二銨0.015，瓊脂2.0，pH 7.4～7.6;③種子培養(yǎng)基:玉米淀粉4.0，黃豆餅粉2.0，蛋白粉0.5，酵母粉0.5，碳酸鈣0.4，硫酸銨0.3，氯化鈉0.2，硫酸鎂0.025，磷酸二氫鉀0.025，培養(yǎng)基裝量25 mL/250 mL三角瓶;④發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米淀粉10，花生餅粉1.5，黃豆餅粉2.5，淀粉酶0.004，氯化鈉0.25，硫酸銨0.5，碳酸鈣0.7，蛋白粉1.4，酵母粉0.2，硫酸鎂0.025，豆油1.25 mL/25 mL，培養(yǎng)基裝量30 mL/250 mL三角瓶。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵效價測定化學(xué)測定法:金霉素在酸性溶液中經(jīng)加熱后能脫去一分子水，生成黃色的脫水金霉素，其色度與含量成正比。故利用比色法來測定其效價。發(fā)酵液經(jīng)草酸酸化過濾后，吸1 mL濾液于9 mL蒸餾水中，分別吸取1 mL稀釋濾液于2只50 mL裝有5 mL 2 mol/L鹽酸的容量瓶中，一只用作CK，另一只于沸水煮沸5 min，冷卻后加水定容至刻度，搖勻后于722N型分光光度計、波長440 nm、光程1 cm測定。

1.2.2 菌種復(fù)合處理及篩選①誘變處理:將培養(yǎng)好的金色鏈霉菌34～55#菌株的新鮮斜面加入20 mL無菌水，用刮棒將成熟孢子輕輕刮下，將制得的孢子懸浮液倒入帶有玻璃珠的三角瓶中振搖15 min。振搖結(jié)束后雙層濾紙過濾，制成單孢子懸浮液。取單孢子懸浮液稀釋100倍后，于培養(yǎng)皿中(每皿加5 mL)，置波長2 357×10-10m，功率20 W的紫外燈下，40 cm處，在磁力攪拌器攪拌下照射10～60 s。將處理好的孢子液，稀釋104倍左右(因孢子濃度不同稀釋103～106倍)，涂布在分離平板上，在溫度35±0.5℃、相對濕度40%～60%條件下培養(yǎng)2～3 d，計算誘變死亡率;②平板分離:將處理好的孢子液，稀釋104倍左右，涂布在含有0.5%氯化鋰的分離平板上，在溫度(35±0.5)℃、相對濕度40%～60%條件下培養(yǎng)4～5 d，用接種針隨機挑取各種形狀的菌落孢子接到試管斜面上培養(yǎng)，將其在溫度(35±0.5)℃、相對濕度40%～60%條件下培養(yǎng)4 d后即得突變菌落;③初篩:將成熟后，生長好的帶孢子斜面挖塊0.5 cm×0.5 cm接入種子瓶中，在溫度(30±0.5)℃、ZP-96型搖瓶機、240 r/min條件下培養(yǎng)24 h后，將長好的種子液按10%接種量接入發(fā)酵瓶中，在溫度(30±0.5)℃、ZP-96型搖瓶機、240 r/min條件下培養(yǎng)5 d后測定其效價。選效價高出CK 10%的菌株進行保藏及傳代;④穩(wěn)定性實驗:斜面?zhèn)?代，主要考察斜面孢子的外觀及生產(chǎn)能力的穩(wěn)定性，經(jīng)過搖瓶測定，選取外觀穩(wěn)定、搖瓶效價穩(wěn)定的菌株進行復(fù)篩。培養(yǎng)條件:溫度(35±0.5)℃、相對濕度40%～60%條件下培養(yǎng)4 d;⑤復(fù)篩:將挑選好的菌株接斜面，然后上搖瓶復(fù)篩，做3批，每批3個平行樣，5 d后測定其效價，選取效價高的菌株自然分離后到發(fā)酵車間進行試生產(chǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外線致死情況

表1是不同時間處理金色鏈霉菌孢子的致死情況，從中可以看出本試驗條件下處理10 s，致死率就達到了接近90%，而處理1 min左右，幾乎全部殺死。

2.2 突變情況

表2說明金色鏈霉菌經(jīng)氯化鋰、紫外線復(fù)合處理后，正突變與負突變都有，但正突變的比率略高于負突變。但效價高于對照10%以上的正突變略低，只有11.4%。效價低于10%的負突變占15.8。

2.3 高效價菌株篩選

從初篩效價高于對照10%以上的菌株中選出13株進行穩(wěn)定性傳代，傳了5代，選出5株斜面生長較好且效價較高的菌株進行復(fù)篩，結(jié)果見表3，可見，19#、20#、111#3株相對效價提高率低于10%，44#、103#均高出對照10%以上。

表1 不同處理時長的死亡率Table 1 Lethal percentage of different treatments

菌株55-44#的特征:菌株55-44#經(jīng)斜面培養(yǎng)后，氣生菌絲較55#豐富，且背部色素分泌多，孢子較為飽滿、整齊，用群體傳代的方法考察了斜面?zhèn)鞔姆€(wěn)定性，傳至5代，生產(chǎn)能力穩(wěn)定。

表2 菌株效價突變分布Table 2 The distribution of titer of mutant bacteria

表3 突變菌株初篩、傳代穩(wěn)定性及復(fù)篩搖瓶效價比較(r/mL)Table 3 The comparison of titer of different mutants in selection

2.4 菌株44-3#的生產(chǎn)能力驗證

表4 44-3#菌株與生產(chǎn)CK的比較(r/ml)Table 4 Comparison between 44-3#and its original bacterium

由菌株55-44#自然分離后得到的菌株44-3#與出發(fā)菌株55#培養(yǎng)成熟的斜面孢子分別經(jīng)種子培養(yǎng)基移種到發(fā)酵培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)，44-3#搖瓶效價比對照高13.1%。因此將其拿到發(fā)酵車間上罐進行試生產(chǎn)，共上60 t發(fā)酵罐15批，生產(chǎn)能力較出發(fā)菌株提高4%以上(表4)，差異達極顯著水平(P＜0.002)。

3 討論

本實驗應(yīng)用紫外線、氯化鋰對金色鏈霉菌進行誘變，得到2株大而飽滿、鼠灰色、草帽型的菌株，命名為55-44#、55-103#，其中55-44#經(jīng)自然分離得到的44-3#菌株搖瓶效價較對照高13.1%。和生產(chǎn)CK相比，生產(chǎn)水平顯著高于CK 4.05%。該菌株后經(jīng)大面積使用，有明顯的增產(chǎn)效果。

［1］ 施巧琴，吳松剛.工業(yè)微生物育種學(xué)［M］.北京:科學(xué)出版社，2009，03.

［2］ Stryzhkova HM，Kopeǐko OP，Lavrinchuk VIa，et al.Spontaneous and induced variability of Streptomyces aureofaciens-chlortetracycline producer［J］.Mikrobiol Z，2002，64(4):19-23.

［3］ 袁琳.采用氯化鋰和紫外線復(fù)合誘變方法篩選四環(huán)素高產(chǎn)菌株［J］.寧夏醫(yī)學(xué)雜志，2000，22(6):340-341.

［4］ 陳梁軍.去甲金霉素高產(chǎn)菌的選育及發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化［J］.海峽藥學(xué)，2010，22(9):203-204.

［5］ 陳紅，王春魁，郭娜，等.微波誘變法選育四環(huán)類抗生素菌種的探索和應(yīng)用［J］.中國抗生素雜志，2008，33(11):2-3.

［6］ 陳梁軍.金霉素發(fā)酵工藝研究［J］.海峽藥學(xué)，2010，22(6):23-25.

［7］ 徐親民.抗生素工藝學(xué)［M］.北京:中國建材工業(yè)出版社，1994，8.