王功玲

(泰山醫(yī)學院附屬泰山醫(yī)院內分泌二科,山東 泰安 271000)

糖尿病(DM)是以慢性血糖升高為特點的代謝性疾病，伴有蛋白質及脂肪的代謝紊亂，久之可引起腎臟、眼、神經等組織嚴重的并發(fā)癥。臨床類型主要分為1型糖尿病(T1DM)和2型糖尿病(T2DM)，T2DM以外周胰島素抵抗、胰島β細胞功能失調及其數(shù)量的減少為特征[1]，而T1DM中，由于自身免疫導致巨噬細胞和T細胞浸潤胰島組織并分泌一些細胞因子，如IL-1β、TNF-α和IFN-γ等，可誘導β細胞凋亡，從而導致β細胞進行性減少[2]。近年來，TNF-α在糖尿病的發(fā)病機制越來越受到人們的重視，它是由激活的單核巨噬細胞和脂肪細胞分泌的一種細胞因子，研究[3]表明，它與糖尿病視網膜病變、胰島素抵抗及β細胞凋亡都有重要的關系。本課題利用體外細胞培養(yǎng)，觀察腫瘤壞死因子-α(TNF-α)對SD大鼠胰島細胞凋亡的影響并探討其機制。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1試劑 TNF-α為PeoroTechEc產品，膠原酶P為ROCHE產品，RPMI 1640培養(yǎng)基為GIBCO產品，F(xiàn)ICOLL-為Pharmacia產品。Trizol試劑為Promega產品。逆轉錄聚合酶鏈式反應試劑盒為Fermentas產品。高保真PCR擴增試劑盒為上海生工生物工程有限公司產品。100 bp DNA Ladder為Fermentas產品。Bcl-2和 Bax引物為invitrogen產品。

1.1.2實驗動物 從泰山醫(yī)學院動物實驗研究室購買50只體重約200～250 g成年雄性SD大鼠。

1.2方法

1.2.1大鼠胰島細胞分離與培養(yǎng) 按董維平[4]法提取胰島細胞。成年SD大鼠，經臀大肌注射1%戊巴比妥鈉麻醉。 消毒，剖腹，經膽總管原位插管，注入預溫的1%膠原酶P溶液(含7.5 mmol/L，hepes 10 mmol/L，pH 7.8)8 ml，分離已膨脹的胰腺，38℃震蕩消化10 min， 于冰Hanks液中撕碎，使呈細砂狀，20目不銹鋼網絲過篩，加入冰Hanks液(含10%小牛血清)終止消化，4℃1000 r/min離心3 min，棄上清，同法洗二次，沉淀加25%Ficoll 4 ml混勻，依次加入23%、20%、11%Ficoll各2 ml和Hanks液2 ml，4℃3000 r/min離心20 min，吸出23%～20%，20%～11%界面的胰島，經Hanks液洗三次，加入含10%小牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液24 ml充分混勻。加入24孔培養(yǎng)板，每孔1 ml，于37℃，5%CO2培養(yǎng)。細胞鋪成單層時，用臺盼藍鑒定細胞活性>85%。

1.2.2胰島細胞分組與處理 將培養(yǎng)第7 d的胰島細胞更換液體, 用Hanks液洗3次, 隨機分組(每一組每一濃度為5孔), 依次分空白對照組，10 ng/ml TNF-α組，30 ng/ml TNF-α組，50 ng/ml TNF-α組。處理時加入上述不同濃度TNF-α培養(yǎng)24 h。

1.2.3TUNEL法檢測細胞凋亡 按試劑盒說明操作：(1)收集貼壁的胰島細胞先用4%多聚甲醛室溫下固定30～60 min，用PBS和蒸餾水洗滌；(2)用新鮮配制3%H2O2室溫處理10 min，蒸餾水洗2 min×3次；(3)加TBS 1∶200新鮮稀釋ProteinaseK 37℃消化10～60 s，TBS洗2 min×3次；(4)每片加標記緩沖液20 μl /片，置于濕盒，37℃標記2 h，TBS洗2 min×3次；(5)加封閉液50 μl /片，室溫下30 min，甩掉封閉液，不洗；(6)用封閉液1∶100稀釋生物素化抗地高辛抗體，50 μl /片加至標本片上，置于濕盒中，37℃反應30 min，TBS洗滌2 min×2次；(7)用TBS 1∶100稀釋SABC(1 ml TBS+10 μl SABC), 37℃反應60 min, TBS洗5 min×4次；(8)取1 ml蒸餾水，分別加入DAB試劑各一滴，顯色10～30 min，水洗；風干、封片,光鏡下觀察, 拍照。

1.2.4用RT-PCR檢測細胞內Bcl-2和 Bax mRNA表達水平 采用Trizol法提取總RNA，按說明書合成cDNA，在TaqDNA聚合酶催化下行聚合酶鏈反應。β-actin上游引物序列為5’-AGA GGG AAA TCG TGC GTG AC-3’，下游引物序列為5’-CGA TAG TGA TGA CCT GAC CGT-3’，擴增產物長度為138 bp。擴增條件：94℃預變性4 min，然后在94℃30 s，60℃30 s，72℃30 s 條件下循環(huán)30周，最后72℃延伸6 min。Bcl-2上游引物序列為5’-CGG GAG ATC GTG ATG AAG TA-3’，下游引物序列為5’-GGT AGC GAC GAG AGA AGT CA -3’，擴增產物長度為284 bp；Bax上游引物序列為5’-CTG CAG AGG ATG ATT GCT GA -3’，下游引物序列為5’-GAT CAG CTC GGG CAC TTT-3’，預計擴增產物長度為174 bp。擴增條件：94℃預變性3 min，96℃變性50 s，62℃復性50 s，70℃延伸50 s，循環(huán)30周，72℃延伸10 min。取6 μl反應產物經1.8%瓊脂糖凝膠電泳后攝片，于凝膠圖像分析儀掃描，分別計算Bcl-2及Bax與β-actin的灰度比值，以其比值分別代表Bcl-2及Bax mRNA的相對量。

2 結 果

2.1胰島細胞凋亡形態(tài)學觀察及凋亡率的計算 顯微鏡下，正常胰島細胞細胞核DNA呈黃色，細胞質和核仁的RNA為桔黃色。而凋亡胰島細胞，細胞核較小，固縮呈較濃的黃綠色，甚至為黃綠色碎塊，并可見凋亡小體，具有凋亡細胞的形態(tài)特征。對照組很少見到凋亡胰島細胞，10 ng/ml TNF-α組見到凋亡細胞增加不明顯，與對照組比較P>0.05，而30 ng/ml和50 ng/ml組凋亡細胞顯著增多，明顯高于對照組，兩者存在劑量依賴關系(圖1～4)。每份樣本于高倍鏡下隨機選取視野，計算100個細胞核，計算凋亡細胞百分率：其凋亡率=凋亡細胞數(shù)/計數(shù)的胰島細胞數(shù)(表1)。

圖1 對照組細胞(×400)

圖2 10 ng/ml TNF-α TUNEL圖片(×400)

圖3 30 ng/m l TNF-α TUNEL圖片(×400)

圖4 50 ng/ml TNF-α TUNEL圖片(×400)

組別凋亡細胞數(shù)凋亡細胞比例(%) 對照組9.94±0.653.92±0.4710 ng/ml TNF-α組11.42±0.804.58±0.4930 ng/ml TNF-α組46.52±1.31ab23.02±3.04ab 5 0ng/ml TNF-α組55.22±1.73 abc25.38±2.78abc

a：P<0.01與對照組比較。b：P<0.01與10 ng/ml TNF-α組比較。c：P<0.05與30 ng/ml TNF-α組比較。

2.2不同濃度的TNF-α對胰島細胞Bcl-2、Bax mRNA表達的影響 各組β-actin mRNA表達水平相差不大，10 ng/ml TNF-α組Bcl-2 mRNA表達水平輕度上升，與對照組相比差異顯著(P<0.05)，30 ng/ml和50 ng/ml TNF-α組Bcl-2 mRNA表達水平明顯下降，明顯低于對照組(P<0.05,圖5及表2)。而隨TNF-α濃度的增加，Bax mRNA的表達水平呈上升趨勢，明顯高于對照組(P<0.05, 圖6及表2)。

表2 不同濃度的TNF-α對胰島細胞Bcl-2、Bax mRNA表達的影響

a：P<0.05與對照組比較；b：P<0.05與10 ng/ml TNF-α組比較；c：P<0.01與30 ng/ml TNF-α組比較;d：P<0.01與10ng/ml TNF-α組比較；e：P<0.01與30ng/ml TNF-α組比較。

圖5 不同組Bcl-2 mRNA的表達

圖6 不同組Bax mRNA的表達

M：Marker；0：正常對照組；10：10 ng/ml TNF-α組；30：30 ng/ml TNF-α組；50：50 ng/ml TNF-α組。

3 討 論

細胞凋亡(apoptosis) 或細胞程序性死亡( Pro-grammed cell death, PCD) 是組織發(fā)育和功能維持的必需生理現(xiàn)象。胰島β細胞凋亡和功能缺陷在糖尿病的發(fā)生和發(fā)展中起著非常關鍵的作用，研究顯示2型糖尿病肥胖患者亞臨床炎癥以及1型糖尿病免疫損傷所導致的高細胞因子水平不僅與外周胰島素抵抗密切相關[5],而且還可造成胰島β細胞的功能缺陷和細胞凋亡[6]。尤其是1型糖尿病，目前認為是一種自身免疫性疾病，細胞免疫反應比體液免疫反應更為重要。細胞因子是細胞免疫的主要效應分子，而腫瘤壞死因子是細胞因子的重要成分之一。此外，動物實驗證明，將TNF-α基因轉入小鼠體內并使其只在胰腺內表達，2個月內即出現(xiàn)明顯的胰腺炎，提示胰島局部TNF-α表達增多與胰島損傷有密切關系。TNF-α可引起胰島細胞凋亡，對于這一現(xiàn)象報道也很多，但確切機制目前尚不清楚。

細胞凋亡是一個受基因調控的主動過程。Bcl-2 家族在調節(jié)細胞凋亡方面起著重要作用。 Bcl-2家族包括抑凋亡基因及促凋亡基因, 抑凋亡基因包括Bcl-2 , Bcl-xl , Bcl-xr，具有抗凋亡的作用；Bax也是Bcl-2家族的成員之一，屬促凋亡基因,可拮抗Bcl-2 的抑凋亡作用。它們之間的表達量的變化與細胞是否存活有密切關系。Bcl-2 基因定位于18q21。Bcl-2基因可在胰島中表達[7]。在胰腺β細胞株和βTC1細胞中，Bcl-2基因高表達能部分保護細胞因子誘導的細胞凋亡，Bcl-2/ Bax比率決定胰島細胞對某些凋亡刺激因素的易感性[8]。研究發(fā)現(xiàn)，高濃度游離脂肪酸可誘導原代培養(yǎng)的大鼠胰島細胞和βTc3細胞凋亡，在胰島細胞凋亡過程中, Bcl-2/ Bax mRNA 表達的比率變化可能起重要作用[9]。

Bcl-2的抗凋亡機制為：(1)Bcl-2主要位于線粒體內膜，這是細胞內活性氧產生的主要場所?？赡芡ㄟ^一種抗氧化劑的作用或抑制氧自由基的形成而抑制細胞死亡[10]。(2)Bcl-2蛋白與其它促凋亡蛋白如Bax相互作用，Bax表達水平增加可拮抗Bcl-2的作用，并且促進凋亡，故兩者的比值決定細胞的死亡與生存[11]。

本實驗以體外培養(yǎng)大鼠胰島細胞作為受試對象，加入不同濃度的TNF-α處理，采用半定量RT-PCR和TUNEL法分別檢測Bax和Bcl-2 mRNA表達變化及細胞凋亡率。結果發(fā)現(xiàn), 10 ng/ml TNF-α組胰島細胞凋亡數(shù)與對照組比較無顯著差異(P>0.05)，30 ng/ml和50 ng/ml TNF-α組胰島細胞凋亡數(shù)與對照組比較顯著增加(P<0.05)。不同濃度的TNF-α引起大鼠胰島細胞凋亡百分率不同, 濃度越高，細胞凋亡越明顯。說明TNF-α對胰島細胞確實存在毒性，且呈劑量依賴關系。同時還發(fā)現(xiàn)：10 ng/ml TNF-α能增加Bcl-2 mRNA表達水平，而30 ng/ml及50 ng/ml TNF-α能顯著降低Bcl-2 mRNA表達水平。而以上濃度的TNF-α均能使Bax mRNA表達水平增加。我們推測，低濃度TNF-α在誘導Bax表達的同時，可使Bcl-2表達一過性增加，這可能是細胞對抗凋亡的的一種自我保護機制；隨濃度的增加，Bax mRNA表達水平持續(xù)增加，而Bcl-2 mRNA 表達水平明顯降低，最終導致細胞凋亡。這也與Tran VV等[12]的研究一致，可見，在TNF-α所致的胰島細胞凋亡中，Bcl-2 /Bax比率變化可能起著重要的作用。

總之，TNF-α所致的胰島β細胞凋亡在糖尿病的發(fā)生和發(fā)展中可能起重要的作用,在這一過程中可能有多種基因和不同機制參與，其中Bcl-2/Bax基因表達的變化在上述異常中可能起著重要的作用。

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