張 輝，宋玲玲，楊宏軍，王洪梅，武建明，候佩莉，何洪彬＊，王立群

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150030；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 奶牛研究中心，山東 濟南250100）

牛傳染性鼻氣管炎（Infectious bovine rhinotracheitis，IBR）是由牛傳染性鼻氣管炎病毒（Infectiousbovine rhinotracheitis virus，IBRV）引起的牛的一種急性、熱性、接觸性傳染病，表現(xiàn)為上呼吸道及氣管粘膜發(fā)炎、呼吸困難、流鼻汁等癥狀，可引起膿皰性外陰陰道炎、龜頭炎、結(jié)膜炎、幼牛腦膜炎、乳房炎、流產(chǎn)等［1-3］。該病在世界范圍內(nèi)流行，1980年我國從新西蘭進口牛中分離到該病毒，目前該病在我國大部分省區(qū)呈上升趨勢。其對牛群肥育率、產(chǎn)奶量及繁殖帶來極大的影響，給全球養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失［4］。該病的危害在于病毒侵入牛體后，可潛伏于三叉神經(jīng)節(jié)造成潛伏感染，病毒的潛伏感染使病牛終身帶毒并周期性向外排毒，給疾病的防治帶來很大困難［5-6］，為此IBR被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為B類傳染病，也是我國進出境動物和國際動物貿(mào)易中規(guī)定的重點檢疫對象［7］。因此加強IBR診斷技術(shù)的研究和藥物開發(fā)對預(yù)防和控制該病具有重要的意義。

IBRV屬皰疹毒科（Herpesviridae）α-皰疹病毒亞科（Alpha-herpesvirinae），IBRV基因組為雙股線性DNA 分子，約138 kb［3］。IBRV 大約編碼40種結(jié)構(gòu)蛋白，有11種為糖蛋白，其中g(shù)D蛋白是IBRV的主要糖蛋白，是病毒粒子表面和病毒感染細(xì)胞的主要分子［8］，與病毒穿透、進入宿主細(xì)胞有關(guān)，能引起宿主體液免疫與細(xì)胞免疫［9］。與其他相關(guān)的幾種糖蛋白比較，gD糖蛋白可大大地降低病毒的復(fù)制和釋放，抗gD抗體中和病毒效果最好，顯示較好的中和滴度［10］。研究表明，去除信號肽和跨膜區(qū)等強疏水序列可明顯提高蛋白的可溶性和表達量，并且分泌形式的蛋白能引起機體更高水平的免疫反應(yīng)［11］。截短表達的可溶性gD蛋白可直接作為抗原建立IBRV的血清學(xué)檢測方法，同時可免疫動物制備高免血清或試制亞單位疫苗。為此，本試驗對gD基因主要抗原表位區(qū)進行截短表達，免疫兔子制備抗血清并初步驗證其抗病毒能力。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌種、質(zhì)粒、病毒、細(xì)胞 大腸桿菌感受態(tài)DH5α、BL21（DE3）均購自寶生物工程（大連）有限公司；p ET32a（＋）質(zhì)粒表達載體，pc DNA3.1（＋）載體、IBRV、293T細(xì)胞、牛腎傳代細(xì)胞MDBK均由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛中心實驗室保存。

1.1.2 試劑 LA Taq酶、T4DNA連接酶及其它限制性內(nèi)切酶、病毒基因組DNA提取試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司；質(zhì)粒提取及膠回收試劑盒購自Biomega公司；Ni-NTA蛋白純化系統(tǒng)為Qiagen公司；弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG抗體均為Sigma產(chǎn)品。

1.2 方 法

1.2.1 病毒基因組DNA的提取 將100TCID50 IBRV（TCID50＝10-7.62／0.1m L）接種于 MDBK 單層細(xì)胞，待細(xì)胞病變達80%時反復(fù)凍融三次，然后按病毒基因組DNA提取試劑盒說明書操作，提取IBRV基因組DNA。

1.2.2 引物合成 根據(jù)GenBank公布的IBRV基因組序列（GenBank登錄號：NC001847），利用分子生物學(xué)分析軟件分析g D基因的跨膜區(qū)、親水區(qū)及表面展示概率選取抗原決定簇較集中且抗原性較強的親水序列作為表達基因，片段長為786 bp，利用引物設(shè)計軟件設(shè)計一對特異性引物（gD-F：5＇-ATGGATCCTTCGCCTACCCCACGGAC-3＇；gD-R：5＇-GCAAGCTTGTTGACGTTGCCAAAGGCC-3＇，引物中引入Bam HⅠ、HindⅢ酶切位點）。同時以IBRV基因組為模板設(shè)計一對擴增gD基因全長用于真核表達的引物（pc-gD-F：5＇-CTCAAGCTTGCCACCATGgactacaaggacgacgatgacaag ATGCAAGG GCCGACATT-3＇；pc-gD-R：5＇-CGCGAATTCGAGGAGGGCCTAGACCGC-3＇，引物中引入HindⅢ酶切位點，EcoRI酶切位點）。引物均由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.3 g D基因表達載體的構(gòu)建與鑒定

1.2.3.1 原核表達載體的構(gòu)建與鑒定 以提取的IBRV基因組DNA為模板，用設(shè)計的引物PCR擴增截短gD主要抗原表位區(qū)基因，產(chǎn)物純化后用Bam HⅠ／HindⅢ雙酶切，然后用T4連接酶將該片段與同樣雙酶切的p ET32a（＋）表達載體連接。轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性重組子，提取重組DNA質(zhì)粒進行Bam HⅠ／HindⅢ雙酶切鑒定。將鑒定正確的重組DNA質(zhì)粒進行序列測定，陽性質(zhì)粒命名為p ET32a-gD。

1.2.3.2 真核表達載體的構(gòu)建與鑒定 以提取IBRV基因組DNA為模板，用設(shè)計引物PCR擴增gD全基因，產(chǎn)物純化后用Hind III／EcoRI雙酶切，定向連接到經(jīng)Hind III／EcoRI雙酶切的pcDNA3.1（＋）表達載體中，挑選陽性重組子，提取重組DNA質(zhì)粒進行Hind III／EcoRI雙酶切鑒定，提取質(zhì)粒并序列測定，陽性質(zhì)粒命名為pcDNA3.1-gD。

1.2.4 gD重組蛋白的誘導(dǎo)表達及可溶性分析 取測序正確的陽性重組質(zhì)粒p ET32a-gD轉(zhuǎn)化BL21（DE3），挑取單菌落接種于5 m L含0.1%氨芐LB中，37℃過夜培養(yǎng)至OD600值為0.6～1.0。過夜菌1%接種于5 m L含0.1%氨芐LB中，190 r／min、37℃培養(yǎng)至OD 600到0.4～1.0之間時，收集1 m L菌液作為未誘導(dǎo)對照。剩余菌液加入IPTG至終濃度1 mmol／L，30℃誘導(dǎo)6 h后取1 m L菌液，離心取菌體用SDS-PAGE檢測目的蛋白表達。

重復(fù)上述方法誘導(dǎo)表達后收集菌體，用預(yù)冷的PBS洗三遍，超聲破碎細(xì)胞，1 200 r／min離心15 min后分別收集上清和沉淀進行SDS-PAGE分析，鑒定目的蛋白是以可溶形式存在于上清中，還是以包涵體存在于沉淀中。

1.2.5 融合蛋白p ET32a-gD的純化 以最佳誘導(dǎo)條件表達蛋白，10 000 g／min收集5 m L誘導(dǎo)后的菌體，加入630μL裂解緩沖液、70μL溶菌酶、10 μLPMSF（100 m M）、1μL胃蛋白酶抑制劑、1μL胰蛋白酶抑制劑，重懸菌體，超聲破碎細(xì)胞（工作2 s：停止6 s），當(dāng)菌液變?yōu)榘胪该鲿r13 000 r／min離心30 min收集上清，依照Ni-NTA純化試劑盒說明書純化p ET32a-gD蛋白。

1.2.6 抗p ET32a-gD蛋白多克隆抗體的制備 選取3月齡雄性新西蘭兔2只，免疫前耳部取血作為陰性對照。將純化的p ET32a-gD蛋白與p ET32a（＋）空載蛋白各1 mg分別與等體積的弗氏完全佐劑混合乳化。采取背部皮內(nèi)多點注射進行第一次免疫；一周后用弗氏不完全佐劑乳化蛋白，雙側(cè)后肢注射進行第二次免疫；10 d后背部皮內(nèi)多點注射加強免疫；加強免疫一周后心臟取血，3 500 r／min、4℃離心10 min分離血清，分裝后-20℃凍存。

1.2.7 多克隆抗體效價測定及特異性檢測 采用間接ELISA法測定抗體效價。將純化的p ET32agD蛋白與p ET32a（＋）空載蛋白分別適當(dāng)稀釋后，每孔100μL（1μg）包被96孔酶標(biāo)板，4℃過夜，用PBST室溫洗滌酶標(biāo)板3次，每次3 min；1%BSA 37℃封閉2 h，洗滌同上，加倍比稀釋待檢血清，以未免疫兔血清作為陰性對照，37℃作用2 h，洗滌同上；加HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1：4 000稀釋）37℃作用2 h，洗滌同上；每孔加入TMB 50μL 37℃避光顯色10 min，加50μL 2 M硫酸終止液，用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定OD值。

將pcDNA3.1（＋）與pcDNA3.1-gD質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，參照Lipofectamine TM2000轉(zhuǎn)染說明書操作，轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞，SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉過夜，加入抗血清（1∶1 000稀釋）37℃搖床孵育2 h。TBST緩沖液洗3次，每次5 min，加入羊抗兔IgG辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記抗體（1∶5 000稀釋）37℃搖床孵育2 h，TBST緩沖液洗3次，加入ECL顯色，暗室曝光。

1.2.8 病毒毒價測定及血清中和試驗 采用TCID50法測定IBRV毒價，將病毒連續(xù)10倍稀釋（10-1～10-10）；接種 MDBK細(xì)胞懸液100μL到96孔板中，使細(xì)胞量達到2～3×105個／m L；將稀釋好的病毒接種到96孔板中，每一稀釋度接種一縱排共8孔，每孔接種100μL，同時設(shè)兩縱排空白對照；連續(xù)5 d觀察并記錄CPE孔數(shù)，Karber法計算毒價。

MDBK細(xì)胞懸液鋪96孔微量培養(yǎng)板；將免疫后血清2倍稀釋，加等量已知毒價的病毒液（與血清混合后，每一接種劑量含100TCID50的IBRV病毒），搖勻置于37℃作用1 h后接種MDBK細(xì)胞；設(shè)空白和100TCID50接毒對照組，連續(xù)5 d觀察并記錄細(xì)胞狀態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增及表達載體鑒定結(jié)果

以IBRV全基因組DNA為模板擴增gD基因PCR結(jié)果見圖1A，擴增截短gD基因PCR結(jié)果見圖1B，表達載體p ET32a-gD用Bam HⅠ／HindⅢ雙酶切見圖1C，pcDNA3.1-gD Hind III／EcoRI雙酶切鑒定結(jié)果見圖1D，PCR擴增片段與酶切鑒定結(jié)果均與預(yù)期相符。

圖1 gD基因擴增結(jié)果及其重組表達載體鑒定M1.DNA Maker DL2 000；M2.DNA Maker DL10 000；1.gD基因擴增結(jié)果；2.截短后gD基因擴增結(jié)果；3.重組表達質(zhì)粒p ET32a-gD的酶切鑒定；4.pcDNA3.1-g D雙酶切鑒定Fig.1 PCR products of gD gene and its identification of recombinant expression vectorM1.DNA Maker DL2 000；M2.DNA Maker DL10 000；1.PCR products of gD gene；2.PCR products of truncated gD gene；3.Identification of recombinant p ET32a-gD plasmid digested by Bam HⅠ／HindⅢ；4.The double digestion of pcDNA3.1-gD by Hind III／EcoRI

2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達及可溶性分析

陽性重組質(zhì)粒p ET32a-gD與p ET32a（＋）分別轉(zhuǎn)化BL21（DE3）表達菌株，IPTG誘導(dǎo)表達后經(jīng)SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示與未誘導(dǎo)組相比重組蛋白大量表達且與預(yù)期蛋白大小相一致。可溶性分析表明，該融合蛋白主要以包涵體形式存在，部分以可溶形式存在（圖2）。

2.3 重組蛋白的純化

以最適誘導(dǎo)表達條件大量表達融合蛋白pET32a-gD和空載蛋白p ET32a（＋），采用 Ni-NTA非變性條件下純化蛋白（圖3），經(jīng)測定蛋白濃度為0.21 mg／m L。

2.4 抗p ET32a-gD蛋白多克隆抗體效價及特異性

圖2 pET32a-g D誘導(dǎo)表達及可溶性分析Fig.2 p ET32a-gD inducing expression and solubility analysis M.Standard protein Marker；1.Non-induced BL21 lysate of p ET32a（＋）；2.Non-induced BL21 lysate of p ET32a-gD ；3.Induced BL21 lysate of p ET32a-gD；4.Culture supernatants of BL21；5.Sediment of culture

圖3 p ET32a-gD蛋白非變性條件純化Fig.3 p ET32a-gD protein was purified under native conditions M.Standard protein Marker；1.Culture supernatants of BL21；2.Protein bind to the NI-NTA resins；3.150-m M imidazole elution；4.250-m M imidazole elution

將抗血清用間接ELISA法檢測效價，結(jié)果顯示該抗血清的效價為1：6400。將pcDNA3.1（＋）與pcDNA3.1-gD質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞用以表達完整gD糖蛋白，以免疫新西蘭兔后獲得的抗血清作為一抗，通過Western-blot檢測該抗血清的特異性，結(jié)果如圖4。從圖4可看出，明顯特異條帶，該抗血清具有明顯的特異性。

2.5 抗血清功能活性檢測

血清中和試驗來初步驗證該抗血清抗病毒的活性，Karber法計算實驗室保存的IBRV毒株TCID50＝10-7.62／0.1 m L。將該抗血清2倍稀釋，加等量100TCID50的IBRV病毒液，搖勻后置于37℃作用1 h，接種MDBK細(xì)胞連續(xù)5 d記錄細(xì)胞病變孔數(shù)，統(tǒng)計數(shù)據(jù)見表1，計算該抗血清中和價為1∶640。

圖4 抗血清Western-blot檢測Fig.4 Western-blot analysis of gD reactivity to antiserum M.Standard protein Marker；1.pcDNA3.1-gD protein；2.pcDNA3.1（＋）protein

表1 血清中和試驗細(xì)胞病變（CPE）孔數(shù)統(tǒng)計Table 1 Statistics for the number of cytopathic effect（CPE）holes in the serum neutralization test

3 討 論

gD糖蛋白是IBRV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，是刺激機體產(chǎn)生中和抗體的最主要的糖蛋白并且與病毒感染和復(fù)制緊密相關(guān)。有研究顯示抗該蛋白的單克隆抗體中和IBR病毒有較高的滴度，Hutchings等［12］分別用gB、gC和gD免疫鼠和牛，結(jié)果顯示gD糖蛋白與其它糖蛋白相比有更高而持久的細(xì)胞免疫。以可溶形式截短表達的gD蛋白具有天然構(gòu)象，純化后可作為抗原篩選針對gD的單克隆抗體。也可以直接作為抗原建立IBRV gD糖蛋白的血清學(xué)診斷方法，可用于IBR的診斷及疫苗免疫效力的評價。祖立闖等［13］以截短表達的gD蛋白作為抗原建立IBRV間接ELISA檢測方法，與全病毒ELISA相比較具有較高的敏感性和特異性。此外，該蛋白也可免疫易感動物制備高免血清用以開發(fā)高效治療傳染性牛鼻氣管炎藥物，也可以成為亞單位疫苗的候選基因。以上表明gD蛋白是研究IBRV首選的特異性抗原。

本試驗利用生物學(xué)軟件分析gD基因主要抗原表位區(qū)，PCR方法擴增786 bp片段，定向連接到p ET32a（＋）表達載體中，并利用大腸桿菌表達系統(tǒng)BL21（DE3）誘導(dǎo)表達了大量融合蛋白，非變性條件下純化可溶性蛋白，具有天然的空間構(gòu)象，免疫兔子制備的抗血清通過ELISA和Western-blot檢測具有較高效價和特異性，利用血清學(xué)中和實驗初步驗證該抗血清的功能，結(jié)果顯示該抗血清能明顯抑制病毒的感染復(fù)制，可初步將本試驗截短的gD基因作為研究IBRV亞單位疫苗的候選基因，為進一步開發(fā)IBR的診斷檢測試劑和亞單位疫苗奠定了重要基礎(chǔ)。

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