戴 悅，吳文清

(1.上海市第八人民醫(yī)院檢驗科，上海200235;2.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院檢驗科，上海200040)

近年來已有許多實驗證明半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(cystatin C，Cys C)是檢測腎功能的新的內(nèi)源性標(biāo)志物［1-2］。Cys C在臨床診斷以腎病為主的疾病具有非常重要的價值。越來越多的實驗室已開展了Cys C的測定。全自動生化分析儀應(yīng)用的原理是液相透射比濁法，而特定蛋白分析儀應(yīng)用原理是顆粒增強散射比濁法。由于檢測原理和儀器不同，不同方法的結(jié)果可能有所差異。為了解液相透射比濁檢測系統(tǒng)和顆粒增強散射比濁檢測系統(tǒng)測定結(jié)果偏差的大小，我們按美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(NCCLS)EP9-A2文件［3］，對以上2種檢測系統(tǒng)進行了方法對比和偏差評價。

材料和方法

一、材料

1.儀器 羅氏MODULAR P800全自動生化分析儀(簡稱P800)和西門子BN-Ⅱ特定蛋白分析儀(簡稱BN-Ⅱ)。

2.試劑及定標(biāo)品 液相透射比濁檢測系統(tǒng)使用廣東虹業(yè)抗體科技有限公司提供的Cys C透射比濁檢測試劑盒(批號:20120301)，配套定標(biāo)品、質(zhì)控品。顆粒增強散射比濁檢測系統(tǒng)使用由西門子公司提供的Cys C測定試劑盒(產(chǎn)品編號:OQNM13，批號:40706)。定標(biāo)品:N蛋白定標(biāo)品UY，批號49854。質(zhì)控品:伯樂52390。

3.樣本收集 從上海市第八人民醫(yī)院檢驗科采集的門診及住院患者的標(biāo)本中，按EP9-A2文件中對比要求選取一定濃度范圍內(nèi)的新鮮血清40份。

二、方法

每天選取8份臨床患者當(dāng)日樣本，分別置于樣本盤1～8號位置上，用2種檢測系統(tǒng)對其進行雙份平行測定。測定順序為1→8，8→1。以上步驟重復(fù)5 d。實驗結(jié)束后質(zhì)控分別在控當(dāng)天實驗結(jié)果才被采用，有一方失控，結(jié)果不予采納，找到失控原因后第2天進行重復(fù)測定。比對方法參考NCCLS EP9-A2文件(用患者樣本進行方法對比以及偏倚評估)。本研究以BN-Ⅱ(顆粒增強散射比濁系統(tǒng))作為對比系統(tǒng)(X變量)，以廣東虹業(yè)抗體科技有限公司提供的Cys C試劑盒和P800組成的液相透射比濁系統(tǒng)作為測試系統(tǒng)(Y變量)，對兩者數(shù)據(jù)進行比對分析。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

統(tǒng)計學(xué)分析方法按偏倚評估程序進行。初步數(shù)據(jù)檢查:計算每種方法的各個樣本雙份測定間差值的絕對值，并以絕對差均值的4倍為可接受限進行數(shù)據(jù)檢查;X變量取值范圍的檢查:修正系數(shù)r作為評價X變量范圍是否足夠?qū)挿旱脑u價指標(biāo);線性回歸分析按下列方程進行描述:Y=bX+a;計算預(yù)期的偏差和可信區(qū)間;作圖運算采用Microsoft Office Excel程序軟件分析。

結(jié) 果

一、初步數(shù)據(jù)檢查

1.方法重復(fù)測試的離群點檢查 為了研究是否有單獨的數(shù)據(jù)點落在范圍之外，需要進行方法內(nèi)重復(fù)測試的離群點檢查。數(shù)據(jù)詳見表1。所有數(shù)據(jù)都要進行離群值檢查，計算可接受限。如果有數(shù)據(jù)點落在范圍之外，則必須對該差異的產(chǎn)生進行分析調(diào)查，并且將落在范圍之外的數(shù)據(jù)點從數(shù)據(jù)庫內(nèi)刪除，重新計算可接受限。當(dāng)有2個以上的數(shù)據(jù)點被刪除，需要對此產(chǎn)生的原因進行分析，找到原因后將數(shù)據(jù)補充完整。如果既沒有找出原因，也無法通過調(diào)整重復(fù)性測定間的最大差異的手段進行調(diào)整，則需要停止實驗并通知廠商。經(jīng)過計算，本研究數(shù)據(jù)均在可接受限范圍內(nèi)。

表1 離群點檢查

2.離群點和非連續(xù)性變量對2方法比較的影響 為了消除非線性關(guān)系，離群點和非連續(xù)性變量對2系統(tǒng)比較的影響，需要作圖進行檢查，觀察2系統(tǒng)測定的數(shù)據(jù)之間是否具有線性關(guān)系。由于長期以來，BN-Ⅱ都具有一定的穩(wěn)定度和準(zhǔn)確性保證，因此將BN-Ⅱ測定數(shù)據(jù)作為橫坐標(biāo)，P800測定數(shù)據(jù)作為縱坐標(biāo)。從圖1中可以觀察到2種系統(tǒng)數(shù)據(jù)呈線性關(guān)系。此外在散點圖的基礎(chǔ)上加了一條通過原點，斜率為1.0的直線。由此圖中觀察到，數(shù)據(jù)并非均勻分布在直線兩邊，而是集中偏向一側(cè)。提示數(shù)據(jù)之間可能存在偏倚，即P800的測定結(jié)果高于BN-Ⅱ的結(jié)果。

圖1 P800和BN-Ⅱ測定結(jié)果的散點圖

3.2種檢測系統(tǒng)的偏差 以［BN-Ⅱ均值(X)+P800均值(Y)］/2得出的數(shù)值為橫坐標(biāo)，以P800均值(Y)減去BN-Ⅱ均值(X)得出的數(shù)值為縱坐標(biāo)。將均數(shù)作為橫坐標(biāo)能更直觀的觀察到整個數(shù)據(jù)的分布。由圖2可見，2種檢測系統(tǒng)數(shù)據(jù)間存在正偏倚。

圖2 BN-Ⅱ與P800結(jié)果的偏差圖

二、2方法的線性回歸分析

按照NCCLS EP9-A2文件，r≥0.975或 r2≥0.95則認為標(biāo)本的取值范圍足夠?qū)?，其測定誤差對回歸估計的影響可忽略不計，可用直線回歸計算斜率和截距。通過直線回歸計算得到結(jié)果為Y=1.216X-0.139，r2=0.978?？梢哉J為測定范圍合適，同時2種檢測系統(tǒng)間線性關(guān)系較好。

三、計算預(yù)期偏差和可信區(qū)間

根據(jù)臨床使用要求，選擇參考區(qū)間(0.53～0.95 mg/L)2個端點和試劑的線性范圍達到的水平7.85 mg/L作為3個醫(yī)學(xué)決定水平，結(jié)合線性回歸方程來評估2種檢測系統(tǒng)間的預(yù)期偏差和95%可信區(qū)間。由于美國臨床實驗室改進修正法案(CLIA'88)中并沒有規(guī)定Cys C的可接受誤差范圍，因此以1/2本實驗室規(guī)定的允許誤差(TEa=20%)為限。Cys C濃度在0.53、0.95 mg/L時的預(yù)期偏差能接受，而濃度在7.85 mg/L時的預(yù)期偏差不可以接受。見表2。

表2 Cys C的預(yù)期偏差和95%的可信區(qū)間

討 論

Cys C是一種半胱氨酸酶抑制物，相對分子質(zhì)量為13 250，可由所有有核細胞產(chǎn)生。隨著其在臨床上的廣泛應(yīng)用和研究的深入［4］，Cys C檢測方法也在不斷進步［5］。要實現(xiàn)同種項目在不同分析系統(tǒng)中的檢測結(jié)果具有可比性是實驗室也是質(zhì)量管理的最終目的。

不同檢測系統(tǒng)影響Cys C測定結(jié)果差異因素主要由于方法學(xué)差異，測定程序校準(zhǔn)差異，不精密度差異，試劑差異，儀器漂移故障等［6］。ISO15189(醫(yī)學(xué)實驗室——質(zhì)量和能力的專用要求)和IS0/IEC17205(檢測和校準(zhǔn)實驗室能力的通用要求)明確提出了醫(yī)學(xué)實驗室檢測結(jié)果的溯源性和可比性。強調(diào)方法學(xué)比對實驗是實現(xiàn)準(zhǔn)確度溯源和患者樣本檢驗結(jié)果可比性的重要途徑［7］。

本研究依據(jù)NCCLS EP9-A2文件對血清Cys C 2種檢測系統(tǒng)進行方法學(xué)對比和偏差評估。結(jié)果顯示2種檢測系統(tǒng)的測定結(jié)果具有較好的相關(guān)性，與文獻［8］結(jié)果基本一致。在0.53、0.95 mg/L濃度時，允許誤差在95%可信區(qū)間范圍內(nèi)，預(yù)期偏差能接受。而在7.85 mg/L濃度時，允許誤差＜95%可信區(qū)間下限，提示2種檢測系統(tǒng)得出得結(jié)果不具一致性，預(yù)期偏差不可以接受。EP9-A2文件(2002)與 EP9-A文件(1995)［9］的不同之處在于EP9-A2文件是計算預(yù)期偏差的95%可信區(qū)間，并判斷 ^Bc的95%可信區(qū)間與可接受誤差的關(guān)系，替代了EP9-A文件中用相對偏差(在Xc濃度上偏差的百分比)來判斷偏差是否可接受。如按照EP9-A用相對偏差來判斷偏差時，分別計算各濃度水平得出相對偏差分別為4.72%、6.95%、19.8%(相對偏差=︱(給定值—預(yù)期值)︱/給定值×100%)，均＜允許誤差(TEa=20%);而由此得出的結(jié)論是各濃度水平的預(yù)期偏差均能接受［10］?？梢?，隨著濃度的增加，相對偏差均增大。但是在高濃度，計算預(yù)期偏差時，EP9-A2文件與EP9-A文件得出的結(jié)論不同。

造成2種檢測系統(tǒng)測定結(jié)果之間差異的主要原因可能是由于標(biāo)準(zhǔn)化溯源性的差異［11］。根據(jù)廠商提供的資料顯示，2種檢測系統(tǒng)中Cys C參考物質(zhì)都是由各自廠商所制備的高純度蛋白，且沒有追溯至國際認證的一級參考物質(zhì)(ERMDA471/IFCC)［12］。另外，有研究表明即使在測量相同的量時，透射比濁法與散射比濁法2種不同的測量程序也會提供不同的結(jié)果［13］。因此要實現(xiàn)Cys C測量程序標(biāo)準(zhǔn)化也是十分重要的。

綜上所述，雖然2種檢測系統(tǒng)之間有所差異，但在測定低濃度樣本時，還是能保證兩者測定結(jié)果的一致性。在高濃度樣本時，應(yīng)注意兩者測定結(jié)果的偏差。

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