黎毓光，何金花，王 莉，謝杏儀，陳順儀，陳武嘉，黃國賢

(廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院檢驗科，廣東廣州511400)

凋亡抑制蛋白(inhibitor apoptosis protein，IAP)最早從桿狀病毒中分離，此后在酵母、昆蟲、人和其他哺乳動物組織中都有發(fā)現(xiàn)，是近年來發(fā)現(xiàn)的具有抗凋亡作用的蛋白家族。目前共發(fā)現(xiàn)IAP 家 族 中 有 XIAP、c-IAP1、c-IAP2、NIAP、Apollon、Livin、Survivin、ILP-2 等 8 個 成員［1］。Apollon/BRUCE是IAP家族中最大的蛋白，相對分子質(zhì)量為530×103，含有4 830個氨基酸，是高爾基體外膜蛋白，具有一個桿狀病毒IAP重復(fù)序列(BIR)結(jié)構(gòu)域及一個泛素結(jié)合酶(ubiquitin conjugating enzyme，UBC)結(jié)構(gòu)域。其中BIR結(jié)構(gòu)域位于IAP的氨基端，是其抑制半胱氨酸蛋白酶(Caspase)活性、抗凋亡的重要結(jié)構(gòu);UBC結(jié)構(gòu)域位于羧基端，能夠加強Apollon的抗凋亡作用。Apollon在人體多種惡性腫瘤中高表達［2］。在前期的研究中，我們篩選出的 IAP家族 Survivin、XIAP、Apollon和 Livin反義核酸(antisense oligodeoxynucleotide，ASO)能抑制人消化系腫瘤細(xì)胞增殖并促進凋亡［3］。本研究重在探討Apollon ASO促進肝癌細(xì)胞凋亡及其機制，期望為肝癌的靶向基因治療提供試驗依據(jù)。

材料和方法

一、主要試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基購自Gibco公司，脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購自 Invitrogen公司，CCK-8(Cell Count Kit-8)試劑購自日本同仁化學(xué)研究所。細(xì)胞色素C單克隆抗體(cell signaling公司)，RIPA細(xì)胞裂解液(上海申能博彩生物科技有限公司)，二辛可酸蛋白測定試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，鼠抗beta-actin多抗(武漢博士德生物工程有限公司)，電化學(xué)發(fā)光試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)。

二、ASO

Apollon ASO(序列 5'-AGCCGCAGCCGCCA TCTTCCG-3')、隨機序列反義核酸(random oligodeoxynucleotide，RODN，序 列 5'-GAGTCGGGA GTCCGATGGCA-3')由北京賽百盛生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，全硫代修飾，聚丙烯凝膠電泳純化，凍存于-20℃，使用前用無血清的DMEM/F12培養(yǎng)液配制成100 μmol/L的濃度備用。

三、細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

人肝癌HepG2細(xì)胞由暨南大學(xué)生化教研室惠贈。細(xì)胞培養(yǎng)體系:DMEM/F12培養(yǎng)液含10%新生牛血清，置37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱，每2～3天用0.25%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。試驗選用對數(shù)生長期、臺盼藍拒染率＞95%的細(xì)胞。試驗時按照脂質(zhì)體 LipofectamineTM2000(μL)∶ASO(μg)為2.5∶1的比例配制。先用無血清DMEM/F12培養(yǎng)液分別將脂質(zhì)體和ASO稀釋至等體積，室溫孵育5 min，然后將脂質(zhì)體與ASO在室溫下混合20 min，再將混合物逐滴加入細(xì)胞培養(yǎng)板中。

四、WST-8法檢測Apollon ASO對HepG2細(xì)胞的增殖抑制

取對數(shù)生長期 HepG2細(xì)胞，用無血清的DMEM/F12培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度為4×104個/mL，接種96孔板，每孔100 μL，設(shè)對照組、ASO 組(終濃度0.05、0.10、0.15、0.20 μmol/L)、RODN 組(終濃度0.20 μmol/L)，48 h后每孔加入 CCK-8試劑10 μL，室溫溫育90 min，多功能酶標(biāo)儀(Bio-Rad)測定吸光度(A)值(激發(fā)波長450 nm，參比波長655 nm)，計算細(xì)胞的增殖抑制率。增殖抑制率=(對照組A值-試驗組A值)/對照組A值×100%。

五、Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測細(xì)胞凋亡

以1.0×106/孔的密度將人HepG2細(xì)胞接種12孔培養(yǎng)板，1 mL/孔，12 h后加入藥物，設(shè)3組即對照組、RODN 組(終濃度 0.20 μmol/L)、ASO組(終濃度 0.05、0.10、0.15、0.20 μmol/L)，培養(yǎng)48 h后消化收集細(xì)胞，采用試劑盒提供的染色緩沖液重懸，加入FITC-AnnexinV試劑和 PI試劑，避光孵育15 min，加入200 μL染色緩沖液，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞早期凋亡率，試驗重復(fù)3次，計算均值。

六、Hochest 33258染色觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

以1.0×106/孔的密度將人HepG2細(xì)胞接種于12孔板，總體積1 mL，12 h后加入藥物，設(shè)3組即對照組、RODN組 (終濃度0.20 μmol/L)、ASO組(終濃度0.20 μmol/L)，培養(yǎng)48 h后消化收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液離心洗2次，涂片，室溫干燥，甲醇-冰醋酸 (3∶1)固定15 min，晾干后于暗處用Hochest33258染色10 min，雙蒸水沖洗，甘油封片，熒光顯微鏡觀察。

七、線粒體膜電位檢測

以1.0×106/孔的密度將人HepG2細(xì)胞接種于12孔板，總體積1 mL，12 h后加入藥物，設(shè)3組即對照組、RODN組 (終濃度0.20 μmol/L)、ASO組(終濃度0.20 μmol/L)，培養(yǎng)48 h后消化收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液洗滌，取500 μL JC-1工作液將細(xì)胞懸浮，置37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中孵育20 min后，孵育緩沖液洗2次，取500 μL孵育緩沖液重懸細(xì)胞，滴1滴細(xì)胞懸液于載玻片上，蓋上蓋玻片，于熒光顯微鏡下觀察。

八、實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)

以1.0×106/孔的密度將人HepG2細(xì)胞接種于12孔板，總體積1 mL，設(shè)3組即對照組、RODN組(終濃度 0.20 μmol/L)、ASO 組(終濃度0.05、0.10、0.15、0.20 μmol/L)，12 h 后加入藥物，培養(yǎng)48 h消化收集各組細(xì)胞，Trizol試劑提取RNA。采用 M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA。作為PCR的模版，Apollon上游引物 5'-CCAAA GGTGGTGAGCTTCA-3'，下游引物 5'-TCTACC CAGCATGGAGGAAC-3'，擴增片段大小 214 bp。GAPDH上游引物5'-AGTGCCAGCCTCGTCTC ATA-3'，下游引物 5'-TTGAACTTGCCGTGGG TAGA-3'，擴增片段大小296 bp。取模板DNA采用SYBRgreen摻入法進行熒光定量PCR，條件如下:95 ℃ 15 s預(yù)變性，95 ℃ 4 s，60 ℃ 15 s，72 ℃15 s，共45個循環(huán)。所有樣本檢測均包含一個不加模板的陰性對照，以排除假陽性結(jié)果。計算參照文獻［4］運用2-△△Ct值來比較對照組和試驗組的目的基因mRNA相對表達量的差異。

九、Caspase-3、Caspase-9 活性測定

以1.0×106/孔的密度將人HepG2細(xì)胞接種于12孔板，總體積1 mL，設(shè)3組即對照組、RODN組(終濃度0.20 μmol/L)、ASO 組(終濃度0.05、0.10、0.15、0.20 μmol/L)，12 h 后加入藥物，培養(yǎng)48 h消化收集各組細(xì)胞。按細(xì)胞裂解液(RIPA)說明書提取細(xì)胞蛋白。用二辛可酸蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，根據(jù)定量結(jié)果對各蛋白質(zhì)樣本進行校正，并調(diào)整蛋白濃度為2.0 μg/μL。每孔吸取50 μL含100 μg蛋白的細(xì)胞裂解液上清，同時取50 μL Lysis Buffer作為空白對照，每50微升2×Reaction Buffer加入0.5 μL二硫蘇糖醇，每孔吸取50 μL已配制 2 ×Reaction Buffer，再加入5 μL Caspase-3 Substrate 或 Caspase-9 Substrate，37℃避光溫育4 h，酶標(biāo)儀測定A405mm。

十、蛋白免疫印跡技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)蛋白的相對表達水平

以1.0×106/孔的密度將人HepG2細(xì)胞接種于12孔板，總體積1 mL，設(shè)3組即對照組、RODN組(終濃度 0.20 μmol/L)、ASO 組(終濃度0.05、0.10、0.15、0.20 μmol/L)，12 h 后加入藥物，培養(yǎng)48 h消化收集各組細(xì)胞。按RIPA說明書提取細(xì)胞蛋白。用二辛可酸蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，根據(jù)定量結(jié)果對各蛋白質(zhì)樣本進行校正。加入樣本溶解液和樣本，置沸水中煮5 min。不連續(xù)的聚丙烯酰胺凝膠電泳(10%聚丙烯酰胺分離膠和5%聚丙烯酰胺濃縮膠)，電壓80 V，進入分離膠后改為120 V，40 min。將凝膠上的蛋白條帶轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，半干式轉(zhuǎn)膜15 V 18 min;TBST洗膜5 min，5%牛血清白蛋白封閉緩沖液室溫封閉1 h，TBST洗膜3次，每次5 min。4℃過夜孵育一抗。TBST洗膜3次，每次5 min。37℃孵育二抗1 h。TBST洗膜3次，每次5 min。加入電化學(xué)發(fā)光試劑，顯影。BI-2000型圖像分析軟件分析細(xì)胞色素 C和 GAPDH的積分光密度，以GAPDH作為內(nèi)參。

十一、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、Apollon ASO對HepG2細(xì)胞增殖的影響

Apollon ASO作用于HepG2細(xì)胞48 h后，在ASO組中，0.05 μmol/L的Apollon ASO可抑制細(xì)胞的增殖，隨著ASO濃度的增高，對細(xì)胞的增殖抑制率增加，并呈劑量依賴性;與RODN組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見圖1。

圖1 不同濃度Apollon ASO對HepG2細(xì)胞增殖抑制的比較

二、Apollon ASO誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡

Apollon ASO作用于HepG2細(xì)胞48 h后，與RODN組及對照組比較，ASO組的早期凋亡率明顯增高 (P＜0.05)，且存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)ASO濃度為0.20 μmol/L時，HepG2細(xì)胞早期凋亡細(xì)胞率為29.3% ±0.46%。見圖2、3。

圖2 不同濃度Apollon ASO誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞早期凋亡流式圖

圖3 不同濃度Apollon ASO誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞早期凋亡率的比較

三、凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

Apollon ASO作用于HepG2細(xì)胞48 h后，對照組細(xì)胞形態(tài)完整，呈低強度熒光;RODN組與對照組相比未見明顯差異;而ASO組呈高強度熒光，細(xì)胞可見核固縮、邊聚、裂解等細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化。見圖4。

四、線粒體膜電位變化

細(xì)胞發(fā)生凋亡時，線粒體跨膜電位被去極化，JC-1從線粒體內(nèi)釋放，線粒體內(nèi)紅光強度減弱(590 nm)，以單體的形式存在于胞液內(nèi)而發(fā)綠色熒光(527 nm)。因此在雙色濾光片下觀察，正常細(xì)胞為高綠高紅，凋亡細(xì)胞為高綠低紅。RODN組與對照組細(xì)胞相似，都表現(xiàn)為++綠++紅(即高綠高紅)，而ASO組細(xì)胞表現(xiàn)為++綠+紅(即高綠低紅)。見圖5。

五、Apollon mRNA的相對表達水平

Apollon基因PCR產(chǎn)物的熔解曲線峰值在78℃，GAPDH的峰值在85℃。熔解曲線分析可見只有單峰值，排除了非特異性擴增。Liva等［4］設(shè)計了一種比較閾值法來測定目的基因的相對表達量 (目的基因的相對表達量 =2-ΔΔCt)。Ct值的含義是:每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達所設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)試驗組-(Ct目的基因-Ct管家基因)對照組，表示基因的差異表達倍數(shù)。不同濃度Apollon ASO作用HepG2細(xì)胞48 h后，均具有下調(diào)其mRNA表達水平的作用。目的基因mRNA的相對表達量隨用藥濃度的增加而減少，具有劑量-效應(yīng)關(guān)系。見圖6。

圖4 Apollon ASO誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞早期凋亡的形態(tài)學(xué)變化(×40)

圖5 Apollon ASO作用于HepG2細(xì)胞線粒體膜電位的變化(×100)

圖6 不同濃度Apollon ASO組細(xì)胞內(nèi)Apollon mRNA相對表達水平的比較

六、Caspase-3、Caspase-9 活性

Caspase-3、Caspase-9在正常狀態(tài)下以酶原的形式存在于胞漿中，沒有活性，但在細(xì)胞發(fā)生凋亡階段被激活，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。隨著 ASO濃度的增高，Caspase-3、Caspase-9的活性明顯增高，與對照組和RODN組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見圖7。

七、細(xì)胞色素C蛋白的相對表達水平

Apollon ASO作用于HepG2細(xì)胞48 h后，隨著Apollon ASO濃度的增加，細(xì)胞色素C蛋白表達水平也增加，表明Apollon ASO促進肝癌細(xì)胞凋亡活化了細(xì)胞色素C。見圖8。

圖7 不同濃度Apollon ASO組細(xì)胞內(nèi)Caspase-3、Caspase-9活性的比較

圖8 不同濃度Apollon ASO組細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素C蛋白相對表達水平的比較

討 論

Apollon/BRUCE的抑制凋亡機制尚不十分清楚。有研究發(fā)現(xiàn)Apollon主要通過結(jié)合Smac、HtrA2以及Caspase等3種機制發(fā)揮其抑制凋亡的作用［5］。Sokka等［6］在離體和在體培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，Apollon表達水平被紅藻氨酸迅速下調(diào)。Caspase-3活化、Apollon表達下降，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡。Apollon在紅藻氨酸導(dǎo)致的神經(jīng)退行性病變中起作用，紅藻氨酸通過下調(diào) Apollon的表達啟動細(xì)胞死亡。Lopergolo等［7］發(fā)現(xiàn)，靶向 Apollon的 siRNA誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡與P53穩(wěn)定性、Caspase-3活性相關(guān)。Qiu等［8］發(fā)現(xiàn)，Nrdp1/FLRF是一個含有RING環(huán)的泛素連接酶，Nrdp1與 BRUCE/Apollon有關(guān)。Apollon含有泛素載體蛋白 E2結(jié)構(gòu)域。E2、UbcH5c、Nrdp1催化 Apollon泛素化。Apollon抑制細(xì)胞凋亡。RNAi技術(shù)抑制Apollon表達，促進細(xì)胞凋亡，Apollon將成為腫瘤治療的靶點［9］。

細(xì)胞色素C是第1種被發(fā)現(xiàn)的線粒體釋放的促凋亡蛋白。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶活化因子(apoptotic prafease activating factor-1，APaf-1)以2∶1的比例結(jié)合，形成細(xì)胞色素 C/APaf-1復(fù)合體。該復(fù)合體可使無活性的Caspase-9原發(fā)生自身活化，繼而形成細(xì)胞色素 C/APaf-1/Caspase-9復(fù)合體。此復(fù)合體繼續(xù)作用于下游的Caspase-3活化?；罨腃aspase-3可以作用于胞質(zhì)中的細(xì)胞骨架蛋白，或作用于細(xì)胞核中DNA酶，引起 DNA 斷裂，引發(fā)凋亡［10］。為了探討Apollon ASO促進肝癌細(xì)胞凋亡的機制，本研究運用Apollon ASO作用于肝癌細(xì)胞48 h后，通過熒光染色觀察線粒體膜電位改變，比色法測定Caspase-3與Caspase-9的活性及蛋白質(zhì)免疫印記技術(shù)檢測細(xì)胞色素C的蛋白表達水平。結(jié)果顯示，Apollon ASO組細(xì)胞發(fā)生凋亡時，線粒體跨膜電位被去極化，熒光減弱;而 Caspase-3與Caspase-9活性明顯增強，細(xì)胞色素C蛋白水平表達也增加。本研究結(jié)果表明，Apollon ASO促進肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡可通過線粒體介導(dǎo)的途徑，是否通過其他途徑，還需進一步試驗驗證。

近年來，新的靶向治療藥物及反義技術(shù)的應(yīng)用已經(jīng)為肝癌的治療開辟了新的前景。反義技術(shù)的基本原理就是根據(jù)堿基互補原則，用人工合成或生物體表達的特定互補的DNA或 RNA片段(ASO)抑制或封閉專一靶基因表達［11］。本研究運用IAP家族中的Apollon ASO轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞，結(jié)果表明Apollon ASO通過下凋 Apollon mRNA基因來抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖，并通過線粒體介導(dǎo)的途徑促進其凋亡。但本研究只采用一株肝癌細(xì)胞為試驗對象，存在一定的局限性，在今后的試驗中我們將繼續(xù)采用不同的肝癌細(xì)胞株作為研究對象，進一步研究 Apollon ASO與Apollon siRNA促肝癌細(xì)胞凋亡及機制，期望Apollon為肝癌的治療提供一個新的靶點。

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