陳碧英，馬晨蕓，李志蘭，陳佩宏，陸志成，郎立中

(上海市第七人民醫(yī)院檢驗科，上海200137)

近年來，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)在世界各地感染率和分離率不斷升高，已成為目前醫(yī)院內(nèi)感染的主要病原菌之一。由于MRSA對所有的β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥，所致感染呈散發(fā)或爆發(fā)流行，治療困難，病死率高，成為臨床治療的一大難題［1］。因此，快速和準(zhǔn)確地檢測MRSA，對于控制醫(yī)院內(nèi)感染的流行，指導(dǎo)臨床治療有著非常重要的意義。本研究將MRSA ID產(chǎn)色培養(yǎng)基法、頭孢西丁紙片擴(kuò)散法、苯唑西林最低抑菌濃度(MIC)法、青霉素結(jié)合蛋白(PBP2a)乳膠凝集法與熒光聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測mecA基因進(jìn)行比較，旨在找出準(zhǔn)確、快速、簡便的適用于臨床微生物實驗室檢測MRSA的方法。

材料和方法

一、材料

1.菌株 收集2010年1月至2012年2月上海市第七人民醫(yī)院臨床分離的金黃色葡萄球菌158株、表皮葡萄球菌12株、溶血葡萄球菌10株、人葡萄球菌1株，共181株葡萄球菌。標(biāo)本來自痰液、咽拭子、膿液、血液，去除同一患者重復(fù)標(biāo)本。所有菌株經(jīng)WalkAway-40微生物鑒定藥物敏感性分析儀鑒定。質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌(ATCC 29213、ATCC 25923)，由上海市臨床檢驗中心提供。

2.試劑 MRSA ID產(chǎn)色培養(yǎng)基、PBP2a乳膠凝集檢測試劑盒為法國生物梅里埃公司產(chǎn)品，頭孢西丁(30 μg/片)紙片為Oxoid公司產(chǎn)品，水解酪蛋白胨瓊脂(MH)平板購自上海科瑪嘉公司，PC20細(xì)菌鑒定藥物敏感性復(fù)合板購自德國西門子公司產(chǎn)品，MRSA耐藥基因檢測試劑盒購自上海之江生物科技有限公司產(chǎn)品。

3.儀器 WalkAway-40微生物鑒定藥物敏感性分析儀為德國西門子公司產(chǎn)品，LightCycler 480Ⅱ熒光定量PCR儀為羅氏公司產(chǎn)品。

二、方法

1.熒光PCR 參照MRSA耐藥基因檢測試劑盒說明書操作和判斷結(jié)果。操作步驟主要包括:(1)核酸裂解處理;(2)反應(yīng)溶液配制;(3)PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

2.MRSA ID產(chǎn)色培養(yǎng)基法 挑取已鑒定過的181株葡萄球菌單個菌落接種到產(chǎn)色培養(yǎng)基上，分區(qū)劃線，于(35±1)℃有氧條件下進(jìn)行孵育，24 h觀察結(jié)果，出現(xiàn)綠色菌落為陽性，判定為MRSA。

3.頭孢西丁紙片擴(kuò)散法 將金黃色葡萄球菌用生理鹽水比濁為0.5麥?zhǔn)蠁挝坏膽乙?，涂布到MH平板上，貼上頭孢西丁藥物敏感性紙片，35℃孵育16～18 h量取抑菌圈直徑，根據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)M100-S20標(biāo)準(zhǔn)，頭孢西丁抑菌圈直徑≤21 mm為耐藥，≥22 mm為敏感［2］。

4.苯唑西林MIC法 用PC20細(xì)菌鑒定藥物敏感性復(fù)合板進(jìn)行細(xì)菌鑒定和藥物敏感性試驗，根據(jù)CLSI金黃色葡萄球菌苯唑西林MIC＞2 μg/mL判斷為MRSA。

5.PBP2a乳膠凝集法 參照MRSA乳膠凝集試劑盒說明書操作和判斷結(jié)果，操作步驟主要包括PBP2a提取和乳膠凝集。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析。以熒光PCR為標(biāo)準(zhǔn)，比較MRSA ID產(chǎn)色培養(yǎng)基法、頭孢西丁紙片擴(kuò)散法、苯唑西林MIC法、PBP2a乳膠凝集法的敏感性、特異性。各種方法與PCR的一致性用Kappa檢驗，Kappa值≥0.75為具有較好的一致性。

結(jié) 果

一、熒光PCR檢測mecA基因

在181株葡萄球菌中，金黃色葡萄球菌陽性158株，mecA基因陽性130株，MRSA 119株，甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)39株，mecA基因陽性其他葡萄球菌11株，mecA基因陰性其他葡萄球菌12株。PCR反應(yīng)曲線見圖1。

圖1 熒光PCR曲線圖

二、MRSA ID產(chǎn)色培養(yǎng)基法、頭孢西丁紙片擴(kuò)散法、苯唑西林MIC法、PBP2a乳膠凝集法檢測MRSA

MRSA ID產(chǎn)色培養(yǎng)基上孵育24 h后，可見119株較大綠色菌落，5株較小綠色菌落，1株較小白色菌落，其余均不生長，判斷為124株陽性;頭孢西丁紙片擴(kuò)散法檢出MRSA 119株;苯唑西林MIC法檢出MRSA 117株;PBP2a乳膠凝集法檢出MRSA 117株。與PCR比較，各種方法敏感性和特異性見表1。

表1 5種檢測MRSA方法的比較

討 論

金黃色葡萄球菌對甲氧西林耐藥，其機制主要是由于攜帶mecA基因，也可能因為產(chǎn)生高水平的β-內(nèi)酰胺酶和獲得性PBP2a以外的其他PBP修飾［3］。目前用于檢測MRSA的方法有多種，檢測mecA基因或mecA表達(dá)的PBP2a是預(yù)報苯唑西林耐藥最準(zhǔn)確的方法［2］。但這2項技術(shù)試驗條件要求高且價格昂貴，不適合臨床實驗室作為常規(guī)方法［4］。

本研究用5種方法檢測了181株葡萄球菌，其中mecA陽性MRSA 119株，4種方法與PCR檢測法比較均有較好的一致性。本研究顯示，頭孢西丁紙片擴(kuò)散法的敏感性和特異性最高，均為100.0%，與PCR檢測mecA基因的Kappa值為1.000，說明完全一致，可見頭孢西丁可作為檢測mecA介導(dǎo)的苯唑西林耐藥的替代品，與Gupta等［5］的研究結(jié)果一致。頭孢西丁紙片擴(kuò)散法簡便易行，也是CLSI推薦的臨床常規(guī)檢測MRSA的方法，但從臨床標(biāo)本中檢測MRSA需48 h。MRSA ID產(chǎn)色培養(yǎng)基法敏感性為100.0%，高于苯唑西林MIC法(97.5%)和PBP2a乳膠凝集法(98.3%)，特異性為91.9%，低于其他方法。鑒定假陽性的5株菌株為PCR mecA基因陽性其他葡萄球菌，可見凝固酶陰性高耐藥的葡萄球菌對顯色可能有一定的干擾，而39株MSSA完全沒有干擾。近年來，國內(nèi)、外各種產(chǎn)色培養(yǎng)基被應(yīng)用于鑒定MRSA［6-7］，也被直接應(yīng)用于血培養(yǎng)瓶、傷口膿液、膿腫的標(biāo)本檢測，18～24 h就能檢測出MRSA［8-9］，縮短了檢測時間，并顯示出了高敏感性和特異性。本研究有1株金黃色葡萄球菌苯唑西林耐藥而mecA基因陰性，分析原因可能與菌株產(chǎn)生高水平的β-內(nèi)酰胺酶或存在PBP2a以外的低親和力PBP有關(guān)，還需進(jìn)一步證實。在mecA基因陽性的菌株中，表現(xiàn)為苯唑西林敏感的3株金黃色葡萄球菌，可能是因為位于mecA啟動子上游的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因mecⅠ的作用特別強大而誘導(dǎo)劑的作用較弱時，mecA基因處于抑制狀態(tài)，表達(dá)PBP2a的量很少［10］，或是輔助基因fem的失活致高耐菌株變?yōu)榈湍途辏?1］，這3株金黃色葡萄球菌頭孢西丁紙片擴(kuò)散法結(jié)果與mecA基因檢測一致，進(jìn)一步證實了頭孢西丁紙片擴(kuò)散法的優(yōu)越性。有研究結(jié)果顯示，頭孢西丁紙片擴(kuò)散法可用于檢測各種表型的MRSA，尤其對低水平、異質(zhì)性耐藥的MRSA，其敏感性高于其他篩選試驗［12］。

MRSA往往表現(xiàn)為多重耐藥，早期檢測不僅是感染控制的關(guān)鍵，也是臨床上決定是否使用糖肽類和惡唑烷酮類抗菌藥物的關(guān)鍵。綜上所述，頭孢西丁紙片擴(kuò)散法是臨床實驗室檢測MRSA的常規(guī)方法，為了避免mecA基因陰性的MRSA漏檢，建議同時做苯唑西林紙片擴(kuò)散法。而應(yīng)用產(chǎn)色培養(yǎng)基法進(jìn)行MRSA快速檢測，將為MRSA院內(nèi)感染爆發(fā)的監(jiān)測、感染的預(yù)防控制以及臨床上抗菌藥物的使用提供快速、可靠的依據(jù)。

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