焦瑞寶，馮恒孝，唐吉斌，方軍，鳳俊蓉，詹三華，周萍，陳然

(1.銅陵市人民醫(yī)院臨檢中心，安徽銅陵244009;2.銅陵市人民醫(yī)院中醫(yī)男科，安徽銅陵244009;3.銅陵市人民醫(yī)院泌尿外科，安徽銅陵244009;4.銅陵市人民醫(yī)院不孕癥科，安徽銅陵244009;5.銅陵市人民醫(yī)院藥劑科，安徽銅陵244009)

世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)顯示，發(fā)達(dá)國(guó)家約有5% ～8%的夫婦受到不孕癥的影響，有的非洲國(guó)家不孕癥的患病率可高達(dá)30%，我國(guó)約為1% ～5%。不孕不育發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì)，男方因素約為一半。而引起男性不育癥的原因很多，比如精神壓力、吸煙酗酒、環(huán)境污染、生活方式改變等。近年來(lái)國(guó)內(nèi)、外研究證實(shí)［1-2］，精液的氧化應(yīng)激(oxidative stress，OS)是造成男性不育的重要原因之一。

在生殖系統(tǒng)中，少量持續(xù)的活性氧(reactive oxygen species，ROS)是精子受精、獲能等生理過(guò)程所必需的，起了重要作用。精液中活性氧的來(lái)源有兩種:(1)人類(lèi)精液中多形核白細(xì)胞(WBC)具有很強(qiáng)的ROS生成能力;(2)精子自身，精子線粒體呼吸鏈上的一系列氧化反應(yīng)產(chǎn)生的，在正常情況下通過(guò)自氧化一種或多種還原物質(zhì)釋放少量的活性氧;另外一種途徑是存在精子膜上的還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶與其底物反應(yīng)生成ROS［1］。當(dāng)生殖道出現(xiàn)感染等情況時(shí)，作為第一道防御機(jī)制的中性粒細(xì)胞∕巨噬細(xì)胞吞噬病原微生物，代謝旺盛，產(chǎn)生過(guò)多的ROS。附睪是精子成熟和儲(chǔ)存的部位，也是生殖道中保護(hù)精子對(duì)抗氧化損傷的重要部位，多種抗氧化物和抗氧化酶的mRNA分布于附睪中［1］。本研究旨在全面分析男性不育精液的氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)精子動(dòng)態(tài)參數(shù)、形態(tài)參數(shù)、功能參數(shù)精子DNA完整性等的影響，探討其作用機(jī)制。

材料和方法

一、研究對(duì)象

選擇2011年9月至2011年12月在銅陵市人民醫(yī)院中醫(yī)男科、泌尿科以及不孕癥門(mén)診就診的92例男性不育患者，排除無(wú)精子癥、精液量過(guò)少(＜0.5 mL)、精液部分丟失者以及資料不全的患者11例，余下81例作為研究對(duì)象(排除女方因素)，患者年齡20～35歲，身體健康，無(wú)睪丸外傷、家族遺傳性疾病史及性功能障礙病史，無(wú)不良生活習(xí)慣(如煙酒等嗜好)，體檢睪丸、附睪及輸精管無(wú)明顯異常。21名健康對(duì)照組來(lái)源于本院年輕職工，年齡25～30歲，妻子剛懷孕滿(mǎn)12周至孩子出生未滿(mǎn)1周歲的男性醫(yī)務(wù)人員作為健康對(duì)照組。

二、儀器及試劑

1.計(jì)算機(jī)輔助精子動(dòng)態(tài)、形態(tài)分析系統(tǒng)由南京大學(xué)捷達(dá)軟件工程有限公司提供;721可見(jiàn)分光光度計(jì)由上海元析儀器有限公司提供;BX41型熒光顯微鏡為OLYMPUS公司產(chǎn)品;KDC-40低速離心機(jī)由安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)。

2.微量丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒、總抗氧化能力試劑盒由江蘇南京建成生物工程研究所生產(chǎn)提供;精子核吖啶橙(AO)染色試劑盒、精子膜檢測(cè)(低滲腫脹法)試劑盒、精液WBC過(guò)氧化酶染色(正甲苯胺法)試劑盒、精子形態(tài)(Diff-Quik)快速染色試劑盒均由深圳華康生物醫(yī)學(xué)工程有限公司生產(chǎn)提供。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1.精液標(biāo)本采集 所有研究對(duì)象按照《世界衛(wèi)生組織人類(lèi)精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(以下簡(jiǎn)稱(chēng)5版)［3］要求在取精前禁欲3至5 d，至少禁欲48 h，手淫法采集精液于干燥無(wú)菌取精杯中，要求在實(shí)驗(yàn)室附近取精室留取，或者在家里留取要求保溫(25～30℃)，在1 h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室。

2.精液動(dòng)態(tài)分析 按5版要求嚴(yán)格操作，將送來(lái)的精液標(biāo)本置37℃水浴箱中，觀察液化狀態(tài)，取充分混勻的精液5 μL置于計(jì)算機(jī)輔助精子動(dòng)態(tài)分析系統(tǒng)上進(jìn)行精子質(zhì)量參數(shù)分析，并記錄檢測(cè)結(jié)果。

3.精子形態(tài)學(xué)分析、精子膜低滲膨脹試驗(yàn)、精液WBC過(guò)氧化酶正甲苯胺染色試驗(yàn) 按5版推薦Diff-Quik快速染色法和 Kruger等［3］標(biāo)準(zhǔn)，在計(jì)算機(jī)輔助精子形態(tài)分析系統(tǒng)上分析200個(gè)精子形態(tài)。在MACRO精子計(jì)數(shù)盤(pán)中，計(jì)算200個(gè)精子中腫脹精子的百分率。涂片在高倍鏡下觀察，其中，棕色細(xì)胞為過(guò)氧化酶陽(yáng)性細(xì)胞，而過(guò)氧化酶陰性細(xì)胞不著色，用精子專(zhuān)用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)棕色細(xì)胞濃度。

4.精液微量MDA測(cè)定 精子膜脂類(lèi)過(guò)氧化反應(yīng)的程度以反應(yīng)產(chǎn)物MDA的產(chǎn)量表示，MDA測(cè)定采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法。取待測(cè)精液0.1 mL為測(cè)定管，并設(shè)測(cè)定空白管，以及標(biāo)準(zhǔn)管及標(biāo)準(zhǔn)空白管，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作，分別加入試劑。直接測(cè)得原始MDA后需要修正，修正MDA是將精子濃度高于20×106/mL的患者調(diào)整為20×106/mL，目的是為了排除由于過(guò)多精子自身產(chǎn)生MDA的影響，通過(guò)換算得到后的濃度［4］。修正MDA的計(jì)算公式=原始MDA÷(精子濃度/20×106/mL)。

5.精液總抗氧化能力(TAC)測(cè)定 精液中有許多抗氧化物質(zhì)，包括酶促與非酶促體系，均能使Fe3+還原成Fe2+，而與Fe2+菲啉類(lèi)物質(zhì)形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，反應(yīng)設(shè)定空白對(duì)照管，通過(guò)比色可測(cè)定出其抗氧化能力的高低。其中，1個(gè)總抗氧化能力單位定義是在37℃，每分鐘每毫升血清(漿)使反應(yīng)體系的吸光度(A)值每增加0.01時(shí)，為1個(gè)總抗氧化能力單位。具體實(shí)驗(yàn)操作參見(jiàn)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)。氧化應(yīng)激指數(shù)(OSI)是評(píng)價(jià)男性不育患者精液內(nèi)活性氧與抗氧化之間的動(dòng)態(tài)平衡的，是在權(quán)衡活性氧指標(biāo)對(duì)精子膜傷害以及精液自身抗氧化系統(tǒng)的狀態(tài)指數(shù)［5］，計(jì)算公式OSI=修正后MDA/TAC×100%。

6.精子DNA完整性的檢測(cè) 精液液化并計(jì)數(shù)，取液化精液1.0 mL加于離心管內(nèi)，1 000×g離心5 min，去除精漿，加1 mL稀釋洗滌液，充分混勻。500×g離心5min，去上清液，如此共洗滌3次;最后1次洗滌完畢，棄上清液，用稀釋洗滌液調(diào)整精子濃度為20×106/mL。取5～10 μL懸浮液于清潔載玻片上涂片，晾干，滴加數(shù)滴乙醛固定液固定10 min，后將玻片直立于吸水紙上以除去固定液;滴加數(shù)滴新鮮配制的吖啶橙工作液染色5 min，流水沖洗，晾干;熒光顯微鏡(OLYMPUS—BX41)觀察(激發(fā)濾光片波長(zhǎng)460～490 nm)，每個(gè)視野觀察時(shí)間不超過(guò)40 s。利用AO異染性，AO與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)出綠色熒光，與單鏈DNA結(jié)合發(fā)出紅色或黃色熒光，計(jì)數(shù)200個(gè)精子中綠色、紅色和橙黃色精子數(shù)。計(jì)算出紅色、橙黃色熒光精子的百分率，即為精子DNA碎片化指數(shù)(DNA fragmentation index，DFI)，精子 DNA 完整性 =1-DFI。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

將81例男性不育患者的活性氧指標(biāo)MDA按原始檢測(cè)結(jié)果劃分:＜5 nmol/mL為30例，5～＜10 nmol/mL為21例，10～＜15 nmol/mL為16例，15～＜20 nmol/mL為5例，≥20 nmol/mL為9例;TAC按檢測(cè)結(jié)果劃分:＜10 U/L為3例，10～＜15 U/L為13例，15～ ＜20 U/L為16例，20～＜30 U/L為23例，≥30 U/L為26例。

將81例男性不育患者按精液分析的結(jié)果分為:少精癥組(精子濃度＜15×106/mL)共5例;活力Ⅰ組為弱精子癥組［即精子前向運(yùn)動(dòng)(PR)＜32%］共31例;活力Ⅱ組為前向運(yùn)動(dòng)精子32% ＜PR＜50%組共25例;活力Ⅲ組為前向運(yùn)動(dòng)PR＞50%組共11例;WBC精子癥組(簡(jiǎn)稱(chēng)為白精癥組，即精液WBC計(jì)數(shù)＞1×106/mL)共9例;另設(shè)健康對(duì)照組21名。各不育組與對(duì)照組的參數(shù)比較見(jiàn)表1。

表1 81例男性不育患者和21名健康對(duì)照組精液參數(shù)的比較

各病例組修正后MDA與健康對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或0.01);隨著精子活力下降，精子MDA呈增加趨勢(shì);且活力Ⅰ組、活力Ⅱ組、活力Ⅲ組MDA濃度分別與少精癥組、白精癥組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。各組TAC值，與健康對(duì)照組TAC比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);活力Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組3組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;少精癥組、白精癥組與其他3組病例組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但呈下降趨勢(shì)。

OSI與各精液參數(shù)的相關(guān)性分析見(jiàn)表2。

表2 OSI與精子分析參數(shù)的相關(guān)性分析

討 論

1979年 Jones等［6］首次提出，人類(lèi)精子對(duì)氧化應(yīng)激特別敏感，氧化應(yīng)激可能是造成男性不育的一個(gè)重要原因。人類(lèi)精子膜含有高濃度的不飽和脂肪酸，并具有多個(gè)雙鍵，這些雙鍵是維持精子膜流動(dòng)性所必需的，脂質(zhì)對(duì)受精過(guò)程中精卵識(shí)別和膜的融合、精子與頂體的融合及精子膜上去能物質(zhì)的清除都有十分重要作用。由于高濃度不飽和脂肪酸極易受自由基的攻擊，這對(duì)精子本身又構(gòu)成了一種潛在的危險(xiǎn)。在氧自由基的攻擊下，精子膜的不飽和脂肪酸發(fā)生脂類(lèi)過(guò)氧化反應(yīng)，使脂肪酸失去雙鍵，進(jìn)而使精子膜失去流動(dòng)性，最終導(dǎo)致精子功能障礙和男性不育。MDA是不飽和脂肪酸代謝終產(chǎn)物之一，其生成量可反映精子膜的脂類(lèi)過(guò)氧化程度。

在精子發(fā)生過(guò)程中，各級(jí)生精細(xì)胞核內(nèi)與DNA結(jié)合的蛋白隨著DNA含量的規(guī)律變化而變化，經(jīng)歷組蛋白到過(guò)渡蛋白再到魚(yú)精蛋白的組型轉(zhuǎn)換。成熟的精子，其DNA與精核蛋白(主要是魚(yú)精蛋白)之間存在著獨(dú)特結(jié)合方式，DNA鏈緊密纏繞魚(yú)精蛋白分子，形成緊密且高度有序的環(huán)，使精子染色質(zhì)高度緊密完整，從而能保護(hù)精子基因免受外部應(yīng)激狀態(tài)損傷。精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析法(SCSA)原理是受損DNA在酸作用下變性為單鏈，利用AO異染性，AO與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)出綠色熒光，與單鏈DNA結(jié)合發(fā)出紅色或黃色熒光。AO熒光染色后，核完整性評(píng)估在熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀下均能完成，兩者原理一致。但與熒光顯微鏡相比，在流式細(xì)胞儀下觀察染色后精子DNA變化更加詳細(xì)準(zhǔn)確，易標(biāo)準(zhǔn)化，且具有較高可復(fù)性、明確的臨床應(yīng)用價(jià)值，被認(rèn)為是精子染色質(zhì)完整性檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”［7］。

活性氧、氧化應(yīng)激與男性不育癥之間的關(guān)系，近來(lái)得到男科以及生殖醫(yī)學(xué)界廣泛關(guān)注。本項(xiàng)目研究為了避免精液離心和冷凍復(fù)蘇對(duì)精液活性氧指標(biāo) MDA 影響，借鑒國(guó)外專(zhuān)家建議［1，5］采用新鮮精液測(cè)定原始MDA含量，同時(shí)采用將原始精子濃度＞20×106/mL換算為20×106/mL得出換算系數(shù)，計(jì)算排除精子濃度過(guò)高由精子自身產(chǎn)生的活性氧帶來(lái)影響，得到修正后MDA水平。修正后MDA含量隨著精子活力的下降，精子MDA呈現(xiàn)增加的趨勢(shì);而且活力Ⅰ組，活力Ⅱ組，活力Ⅲ組的MDA濃度分別與少精癥組、白精癥組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);說(shuō)明精液內(nèi)過(guò)多活性氧存在導(dǎo)致精子膜發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)產(chǎn)生MDA，破壞精子膜結(jié)構(gòu)的完整性，引起精子運(yùn)動(dòng)能力下降，引起精子正常形態(tài)率降低。而TAC測(cè)定采用精漿，不受精子濃度的影響，相對(duì)比較穩(wěn)定。

近年來(lái)，國(guó)外多位專(zhuān)家［1，5］倡導(dǎo)新指標(biāo)—OSI評(píng)價(jià)精液氧化應(yīng)激水平，應(yīng)用精子活性氧與TAC比值來(lái)?yè)Q算得到，該指數(shù)兼顧活性氧含量、TAC之間變化因素。研究顯示，精液OSI與精子濃度及總數(shù)、MDA含量以及核DNA碎片化指數(shù)(DFI)成正相關(guān)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01);OSI與精子活率、PR、VAP、VSL、HOS、快速直線運(yùn)動(dòng)精子濃度及總數(shù)、TAC以及正常形態(tài)率呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。與毛毳等［8］開(kāi)展的體外人工試驗(yàn)有相似之處。生殖系統(tǒng)如急慢性炎癥、細(xì)菌、支原體和衣原體等感染，多種疾病、不良生活習(xí)慣等均可引起局部氧自由基增加導(dǎo)致精液的氧化應(yīng)激反應(yīng)，氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致精子膜完整性降低，精子運(yùn)動(dòng)能力下降，正常形態(tài)率下降［9］。精子DNA核酸含有親核基團(tuán)，活性氧自由基能與其堿基反應(yīng)使DNA鏈聚集，改變DNA正常結(jié)構(gòu)，造成DNA鏈斷裂，也通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化作用影響DNA，引起超氧化物歧化酶(SOD)基因表達(dá)變化，使合成減少，核DNA碎片化指數(shù)上升［10］。

氧化應(yīng)激反應(yīng)是近來(lái)受到較多關(guān)注男性不育病因之一，由于各種因素引起活性氧產(chǎn)生過(guò)多，TAC的下降，精液發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，可造成精子動(dòng)態(tài)參數(shù)、形態(tài)參數(shù)，以及功能參數(shù)的改變。這些改變可能是氧化應(yīng)激反應(yīng)引起男性不育的重要機(jī)制之一。

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