趙恩宏 許 倩 肖麗君 劉 鐳 趙 爽 高亞賢 鄭 鑫

雖然近年胃癌發(fā)病率有所下降，但仍然位居惡性腫瘤中第二位，嚴重威脅人類的健康［1］。我國胃癌死亡率居惡性腫瘤首位，占23%。影響胃癌治療和預(yù)后的關(guān)鍵因素是很多胃癌在發(fā)現(xiàn)早期即存在較大范圍的局部侵襲，甚至轉(zhuǎn)移。侵襲和轉(zhuǎn)移是胃癌患者死亡的主要原因。腫瘤血管新生是腫瘤侵潤轉(zhuǎn)移必不可少的一個環(huán)節(jié)，抗腫瘤藥物對腫瘤血管新生的抑制作用越來越受到重視。17-烯丙胺-17-脫甲氧格爾德霉素（17-allylamino-17-desmethoxy-geldanamycin，17-AAG）是熱休克蛋白90抑制劑，通過和熱休克蛋白90特異性結(jié)合，降解其客戶蛋白而發(fā)揮抗腫瘤作用。目前國內(nèi)外研究主要集中于17-AAG誘導(dǎo)腫瘤凋亡、干擾細胞周期等作用。曾有報道顯示17-AAG有抑制腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及新生血管生成的效果。在前期研究的工作基礎(chǔ)上，我們觀察了17-AAG對胃癌MKN-45細胞增殖的抑制作用及對VEGF、STAT3基因和蛋白表達的影響，本研究旨在探尋17-AAG是否能夠通過作用于STAT3而發(fā)揮對VEGF的負性調(diào)控作用，初步探討STAT3通路在17-AAG調(diào)控胃癌侵襲和血管生成中所發(fā)揮的作用，為17-AAG對胃癌的治療提供潛在的新靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 DMEM培養(yǎng)基、瓊脂糖、溴化乙錠購自GIBCO BRL公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；17-AAG購自深圳生爾易美有限公司；MTT購自美國Peprotech公司；Trizol總RNA提取試劑購自Invitrogen公司；RT-PCR試劑盒、DNA Marker購自大連Ta-KaRa公司；引物購自上海生工公司；STAT3單克隆抗體購自美國Epitmics公司；VEGF和β-ACTIN單克隆抗體購自美國Santa公司；辣根酶標記羊抗兔和羊抗鼠IgG購自美國KPL公司；BCA蛋白定量試劑盒購自博奧森公司；Prestained Protein Ladder購自Fermentas公司；ECL超敏發(fā)光液購自普利萊公司。

1.1.2 細胞來源 胃癌MKN-45細胞株為附屬醫(yī)院中心實驗室饋贈。

1.1.3 儀器 SW-CT-2F超凈工作臺；XD-101倒置顯微鏡；LD5-2A離心機；Heraeus BB5060CO2培養(yǎng)箱；B10-RAD 680酶標儀；PCR儀為BIO-Rad公司；96孔細胞培養(yǎng)板為美國Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 胃癌MKN-45細胞株生長在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱，每3d換液，進行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 MTT法測定細胞增殖情況 體外培養(yǎng)細胞至對數(shù)生長期，貼壁細胞用0.25%胰酶消化后，制成單細胞懸液，計數(shù)，離心，調(diào)整細胞濃度為5×104/mL，190 μL/孔加入到96孔板，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h，之后分別加入陽性對照藥DOC和17-AAG，使其中終濃度為 0.160、0.31、0.62、1.25、2.50、5.00、10.0 mg/L，每個濃度設(shè)5個復(fù)孔，同時設(shè)立對照組（不加藥組）和空白對照組（不加細胞也不加培養(yǎng)液）作為對照。培養(yǎng)24 h和48 h后，每孔加入5 g/L新鮮配制的MTT 10 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，小心吸取上層培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL，震蕩10 min，待藍色結(jié)晶完全溶解后，在酶標儀492 nm、540 nm、650 nm波長處檢測各孔的OD值。計算17-AAG對腫瘤細胞的生長抑制率=（1-藥物孔OD值/對照孔OD值）×100%。以同一樣品的不同濃度對腫瘤細胞的抑制率作圖可得到劑量反應(yīng)曲線，并進行回歸計算，通過回歸計算半數(shù)抑制濃度，即IC50。

1.2.3 RT-PCR法檢測17-AAG作用后胃癌MKN-45細胞株VEGF、STAT3基因mRNA的表達 1）總RNA的提?。航K止培養(yǎng)后，每孔加入500 μL Trizol提取液，按照試劑提取操作流程進行RNA提取，測定RNA濃度、完整度和純度；2）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA：參照TaKa-Ra公司RT-PCR（AMV）試劑盒的具體步驟和要求，依次加入總RNA 1.5 μg，10×RT buffer 1 μL dNTPmix1μL，MgCL22 μL，Oligo16-180.5μL，RNase Inhibitor 0.25μL，補水至總反應(yīng)體系為20 μL，充分混勻后置于常規(guī)PCR儀中，設(shè)定溫度：30℃、10 min，42℃、30 min，99℃、5 min，5℃、5 min。所得cDNA產(chǎn)物置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?）RT-PCR：參照試劑說明書的具體要求和步驟，擴增條件見表1。

表1 RT-PCR引物序列和產(chǎn)物大小及反應(yīng)條件Table1 Primer sequences，products size and conditions for RT-PCR

將產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳，恒壓120 V，30 min，UVP成像分析系統(tǒng)拍照觀察。圖片掃描圖像用Quantity One軟件進行灰度分析，每組實驗至少重復(fù)5次，計算目的基因條帶與內(nèi)參照（β-actin）的灰度比值。

1.2.4 Western Blotting法檢測17-AAG作用后胃癌MKN-45細胞株STAT3、VEGF蛋白的表達 1）總蛋白的提?。后w外培養(yǎng)細胞至對數(shù)生長期，貼壁細胞用0.25%胰酶消化后，制成單細胞懸液，計數(shù)，離心，調(diào)整細胞濃度為5×104/mL，3 mL/孔加入6孔板，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h，之后分別加入17-AAG，使其中終濃度為1.0、2.0、3.0、5.0 mg/L，每個濃度設(shè)5個復(fù)孔，同時設(shè)立對照組（不加藥組）作為對照。48 h后終止培養(yǎng)，溫和PBS洗細胞2次，加入冰預(yù)冷的適量細胞裂解液，冰上裂解20 min，4℃，12 000 rpm離心20 min，收集上清，按照BCA蛋白定量試劑盒說明進行定量。

2）取 50 μg蛋白與 5×SDS加樣緩沖液混合，100℃變性5 min，用8%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以含5%脫脂奶粉TBS-T溶液（10 mmol/L Tris-CL，100 mmol/L NaCL+0.1%Tween 20）封閉，室溫下與兔抗人STAT3、VEGF單克隆抗體（1∶300稀釋）共同孵育，再與相應(yīng)的HR-PO抗Ig抗體耦聯(lián)物（1∶2 000稀釋）孵育，以上步驟間用TBS-T常溫下充分洗膜。ECL檢測試劑盒顯影，洗片。同樣方法，以β-actin（1∶100稀釋）雜交做為內(nèi)對照。膠片經(jīng)掃描儀掃描后獲得圖像，用Quantity one分析軟件測定條帶灰度值，計算STAT3、VEGF的相對含量＝STAT3、VEGF蛋白條帶灰度值/內(nèi)對照β-actin蛋白條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)資料用±s表示，采用單因素方差分析或重復(fù)測量資料的方差分析對數(shù)據(jù)進行處理。單因素方差分析兩兩比較時采用SNK-q檢驗。以P≤0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 17-AAG對MKN-45細胞增殖影響

結(jié)果表明，17-AAG在體外細胞試驗中其濃度0.165～10 μg/mL時對胃癌MKN-45細胞有顯著的抑制作用，且有明顯的量效關(guān)系；體外作用48 h的抑制率優(yōu)于24 h（表2，圖1）。

表2 17-AAG體外不同作用時間對MKN-45細胞抑制率（n=5，±s，%）Table2 Inhibition ratio of 17-AAG at various action times in vitro on MKN-45 cells

表2 17-AAG體外不同作用時間對MKN-45細胞抑制率（n=5，±s，%）Table2 Inhibition ratio of 17-AAG at various action times in vitro on MKN-45 cells

P＜0.01 vs. control group；△IC50：the mean value of three repetition

P＜0.01 vs.control group；△IC50：the mean value of three repetitionInhibitory rate 45.79 39.52 34.75 31.7 21.75 19.1 18.1748 h after transfection 8.32

圖1 17-AAG體外不同作用濃度對人胃癌MKN-45細胞抑制率Figure1 Inhibition ratio of various concentrations of 17-AAG in vitro on MKN-45 human gastric cancer cells

2.2 人MKN-45細胞株STAT3、VEGF基因mRNA的表達

2.2.1 不同作用濃度17-AAG對人MKN-45細胞STAT3、VEGF基因mRNA表達的影響 結(jié)果表明，17-AAG分別以1.00、2.00、3.00、5.00 mg/L的濃度作用于各組細胞48h后，VEGF、STAT3 mRNA的表達量逐漸降低，呈一定的濃度依賴性。各實驗組與對照組，各組之間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表3，圖2）。

表3 不同作用濃度17-AAG對MKN-45細胞系VEGF、STAT3基因mRNA表達的影響（±s）Table3 Effect of various concentrations of 17-AAG on STAT3 and VEGF gene mRAN expressions in MKN-45 cells

表3 不同作用濃度17-AAG對MKN-45細胞系VEGF、STAT3基因mRNA表達的影響（±s）Table3 Effect of various concentrations of 17-AAG on STAT3 and VEGF gene mRAN expressions in MKN-45 cells

*P＜0.05 vs.control group；△P＜0.05 vs.1.0μg/mL group；▲P＜0.05 vs.2.0μg/mL group；☆P＜0.05 vs.3.0 μg/mL group；■P＜0.05

Group 1 2 3 4 5 F Concentration of 17-AAG（μg/mL）Control 1 2 3 5 n 5 5 5 5 5STAT3/β-ACTIN 2.7±0.02 1.54±0.04△1.29±0.04△▲1.22±0.02△▲☆0.83±0.06△▲☆■VEGF/β-ACTIN 0.94±0.06 0.73±0.06△0.57±0.04△▲0.42±0.05△▲☆0.23±0.05△▲☆■136.00**P＜0.05 vs.control group；△P＜0.05 vs.1.0μg/mL group；▲P＜0.05 vs.2.0μg/mL group；☆P＜0.05 vs.3.0 μg/mL group；■P＜0.05

圖2 不同作用濃度17-AAG對MKN-45細胞中STAT3、VEGF mRNA表達的影響Figure2 Effect of various concentrations of 17-AAG on STAT3 and VEGF mRAN expressions in MKN-45 cells

2.2.2 不同作用時間17-AAG對MKN-45細胞STAT3、VEGF mRNA表達的影響 結(jié)果表明，以3.0 mg/L 17-AAG作用于MKN-45細胞12、24、48 h后，VEGF、STAT3 mRNA的表達量逐漸降低，呈一定的時間依賴性。各實驗組與對照組，各組之間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表4，圖3）。

表4 不同時間17-AAG對人MKN-45細胞STAT3、VEGF mRNA表達的影響（±s，n=5）Table4 Effect of various concentrations of 17-AAG on STAT3 and VEGF protein expressions in MKN-45 human cells

表4 不同時間17-AAG對人MKN-45細胞STAT3、VEGF mRNA表達的影響（±s，n=5）Table4 Effect of various concentrations of 17-AAG on STAT3 and VEGF protein expressions in MKN-45 human cells

*P＜0.05 vs.control group；△P ＜0.05 vs.12h group；▲P ＜0.05 vs.24 h group；☆P＜0.05

Group 1 2 3 4 F Time（h）Control 12 24 48 n 5 5 5 5STAT3/β-actin 8.27±0.18 6.23±0.34△4.44±0.26△▲2.29±0.26△▲☆VEGF/β-actin 0.49±0.04 0.43±0.05△0.26±0.04△▲0.10±0.01△▲☆111.25**P＜0.05 vs.control group；△P ＜0.05 vs.12h group；▲P ＜0.05 vs.24 h group；☆P＜0.05

圖3 不同作用時間17-AAG對MKN-45細胞中VEGF、STAT3 mRNA表達的影響Figure3 Effect of 17-AAG at various action times on VEGF and STAT3 mRNA expressions in MKN-45 cells

2.3 人MKN-45細胞STAT3、VEGF蛋白的表達

2.3.1 不同作用濃度17-AAG對人MKN-45細胞系STAT3、VEGF蛋白表達的影響 結(jié)果表明，17-AAG分別以1.00、2.00、3.00、5.00 mg/L的濃度作用于各組細胞48 h后，各組細胞STAT3、VEGF蛋白的表達量逐漸降低，呈一定的濃度依賴性。各實驗組與對照組，各組之間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表5，圖4）。

表5 不同濃度17-AAG對人MKN-45細胞系STAT3、VEGF蛋白表達的影響（±s，n=5）Table5 Effect of 17-AAG at various action times on STAT3 and VEGF mRNA expressions in MKN-45 human cells

表5 不同濃度17-AAG對人MKN-45細胞系STAT3、VEGF蛋白表達的影響（±s，n=5）Table5 Effect of 17-AAG at various action times on STAT3 and VEGF mRNA expressions in MKN-45 human cells

*P＜0.05 vs.control group；△P＜0.05 vs.1.0μg/mL group；▲P＜0.05 vs.2.0 μg/mL group；☆P＜0.05 vs.3.0 μg/mL group；■P＜0.05

VEGF/β-ACTIN 1.19±0.08 1.00±0.06△0.83±0.05△▲0.71±0.04△▲☆0.62±0.07△▲☆■78.92**P＜0.05 vs.control group；△P＜0.05 vs.1.0μg/mL group；▲P＜0.05 vs.2.0 μg/mL group；☆P＜0.05 vs.3.0 μg/mL group；■P＜0.05

圖4 不同濃度17-AAG對MKN-45細胞中STAT3、VEGF蛋白表達的影響Figure4 Effect of various concentrations of 17-AAG on STAT3 and VEGF protein expressions in MKN-45 cells

2.3.2 不同作用時間17-AAG對人胃癌MKN-45細胞STAT3、VEGF蛋白表達的影響 結(jié)果表明，以3.0 mg/L的 17-AAG 作用于 MKN-45細胞 12、24、48 h后，STAT3、VEGF蛋白表達量逐漸降低，呈一定的時間依賴性。各實驗組與對照組，各組之間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表6，圖5）。

表6 不同時間17-AAG對人MKN-45細胞系STAT3、VEGF蛋白表達的影響（±s，n=5）Table6 Effect of 17-AAG at various action times on STAT3 and VEGF protein expressions in MKN-45 human cells

表6 不同時間17-AAG對人MKN-45細胞系STAT3、VEGF蛋白表達的影響（±s，n=5）Table6 Effect of 17-AAG at various action times on STAT3 and VEGF protein expressions in MKN-45 human cells

*P＜0.05 vs.control group；△P＜0.05 vs.12 h group；▲P＜0.05 vs.24 h group；☆P＜0.05

Group 1 2 3 4 F Time（h）Control 12 24 48 n 5 5 5 5STAT3/β-actin 1.68±0.09 1.19±0.05△1.00±0.06△▲0.40±0.05△▲☆VEGF/β-actin 1.04±0.06 0.85±0.05△0.68±0.03△▲0.50±0.04△▲☆124.44**P＜0.05 vs.control group；△P＜0.05 vs.12 h group；▲P＜0.05 vs.24 h group；☆P＜0.05

圖5 不同時間17-AAG對MKN-45細胞中STAT3、VEGF蛋白表達的影響Figure5 Effect of various concentrations of 17-AAG on STAT3 and VEGF protein expressions in MKN-45 cells

3 討論

腫瘤血管新生是腫瘤侵潤轉(zhuǎn)移必不可少的一個環(huán)節(jié)。癌組織中的新生血管不僅為腫瘤細胞增殖提供了養(yǎng)分，亦為瘤細胞提供了遷移的通道，大量的癌細胞可由此進入循環(huán)系統(tǒng)而向遠處轉(zhuǎn)移。自1971年Judah Folkman首次提出腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于血管生成的假說，抗腫瘤藥物對腫瘤血管新生的抑制作用越來越受到重視。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一種參與機體所有（胚胎發(fā)育、生理、病理）血管生成的細胞因子，也是迄今研究最多且最深入的腫瘤新生血管標志分子。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化蛋白（signal transducer and activator of transcriptions，STATs）是一種重要的信號級聯(lián)分子，參與細胞生長、分化及發(fā)育等多種生理過程。STAT在多種人類惡性腫瘤組織及細胞系中存在高表達，而在正常組織中卻很少或沒有STAT的活化［2］。尤其是STAT3，目前認為可能是一種癌基因，其參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑異?？赡茉谀[瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移中起重要作用。當細胞因子或生長因子激活STAT3上游的JAK或SRC酪氨酸激酶后，使STAT3活化形成p-STAT3，進而形成二聚體轉(zhuǎn)入細胞核，調(diào)節(jié)多種與腫瘤細胞轉(zhuǎn)化、增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等相關(guān)的靶基因轉(zhuǎn)錄活性［3-4］。有報道顯示，STAT3可通過調(diào)節(jié)某些激酶作用，破壞E-鈣粘附蛋白（E-cadherin）/b-鏈蛋白（b-catenin）復(fù)合物，使b-鏈蛋白的酪氨酸磷酸化后從細胞膜釋放，從而使細胞間粘附能力下降，使腫瘤細胞容易從原發(fā)灶脫離出來，促進腫瘤轉(zhuǎn)移［5］。阻斷腫瘤細胞中癌基因STAT3信號傳導(dǎo)通路可以起到治療腫瘤的作用。VEGF的表達受諸多因素的調(diào)控，最近的研究表明，STAT3能直接調(diào)控VEGF的轉(zhuǎn)錄［6-7］。研究顯示：持續(xù)激活STAT3能誘導(dǎo)VEGF的表達，導(dǎo)致腫瘤新生血管形成；用STAT3的顯性負性突變體或反義寡核苷酸阻斷STAT3信號通路能抑制由Src和IL-6介導(dǎo)的VEGF的表達上調(diào)，從而抑制腫瘤的生長與侵襲轉(zhuǎn)移。另有研究表明，STAT3介導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞中VEGFR信號通路，其在血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移及微血管的形成中是必需的，阻斷STAT3的激活，能抑制內(nèi)皮細胞的遷移及微血管的形成［8］。STAT3可能是促進腫瘤新生血管形成的關(guān)鍵因素之一。

17-烯丙胺-17-脫甲氧格爾德霉素（17-allylamino-17-desmethoxy-geldanamycin，17-AAG）是熱休克蛋白90抑制劑，通過和熱休克蛋白90特異性結(jié)合，降解其客戶蛋白而發(fā)揮抗腫瘤作用，近年來備受關(guān)注。17-AAG抗多種腫瘤如乳腺癌、黑色素瘤等研究已進入了Ⅱ期臨床［9-10］。腫瘤血管新生是腫瘤侵潤轉(zhuǎn)移必不可少的一個環(huán)節(jié)，對于抑制乳腺癌侵襲和血管生成靶向藥物是當今的研究熱點，目前已有幾種應(yīng)用：如重組人源性抗VEGF單克隆抗體貝伐單抗，抗HER-2單克隆抗體曲妥珠單抗及帕妥珠單抗，小分子EGFR酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼及拉帕替尼等。但以上藥物均為單一靶向藥物，HSP90是癌細胞中生長信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的樞紐，底物蛋白眾多，因此以HSP90為作用靶點的17-AAG與作用于單一靶點的抗乳腺癌藥物相比無疑具有明顯的優(yōu)勢。Cheong等［11］報道，異澤蘭黃素可以通過阻斷對胃癌MKN-45細胞的STAT3通路而抑制VEGF表達。本文研究結(jié)果顯示，0.165～10 mg/L的17-AAG作用24h、48h后對MKN-45細胞有顯著的抑制作用，且有明顯的時間、劑量依賴性；選取48 h的時間點結(jié)果顯示，1.0、2.0、3.0、5.0 mg/L 的 17-AAG 作用后，對MKN-45細胞STAT3和VEGF的mRNA和蛋白表達均下調(diào)，且具有濃度依賴性；選取3.0 mg/L的濃度點，17-AAG 作用 12、24、48 h后，各組細胞STAT3和VEGF mRNA和蛋白表達均下調(diào)，且具有時間依賴性。其中17-AAG尤其對STAT3下調(diào)作用尤為顯著。

根據(jù)以上實驗結(jié)果，本文研究認為17-AAG從基因水平和蛋白水平都抑制了STAT3的表達，VEGF作為STAT3的下游底物，進而其基因和蛋白也均被負性調(diào)控而表達降低。結(jié)合相關(guān)文獻報道，研究實驗提示17-AAG可能通過阻斷STAT3通路而下調(diào)VEGF的表達進而發(fā)揮抗腫瘤血管新生作用。但是由于腫瘤細胞的血管新生所涉及的步驟和環(huán)節(jié)復(fù)雜，而17-AAG作用靶點眾多，STAT3的下游分子也種類很多，故后續(xù)工作我們將通過體外和體內(nèi)工作進一步探尋STAT3通路的上游或下游是否還存在其他因子直接或間接調(diào)控VEGF的表達，或17-AAG是否通過抑制STAT3而對其他血管新生相關(guān)分子也發(fā)揮調(diào)控作用。我們的研究將進一步豐富17-AAG的作用靶點，為17-AAG針對胃癌的治療提供實驗數(shù)據(jù)，為17-AAG在臨床上的進一步開發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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