摘要：建立以高效液相色譜熒光（HPLC-FLD）法測定胡椒（Piper nigrum L.）中阿維菌素含量的方法。樣品用乙腈提取，經(jīng)氨基柱凈化，衍生后，以HPLC-FLD法分析。結(jié)果表明，該法在添加回收濃度為0.005，0.010和0.050 mg/kg 3個不同添加水平的回收率為95%～103%，其檢出限為0.005 mg/kg。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜熒光法；阿維菌素；殘留；胡椒（Piper nigrum L.）

中圖分類號：O657.7 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）02-0425-03

阿維菌素（Abamectin，AVM）是由鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，屬昆蟲神經(jīng)毒劑，主要干擾神經(jīng)生理活動，刺激釋放γ-氨基丁酸，而γ-氨基丁酸對節(jié)肢動物的神經(jīng)傳導(dǎo)有抑制作用，害蟲與藥劑接觸后即出現(xiàn)麻痹中毒而死，無內(nèi)吸性[1]。由于具有殺蟲性強(qiáng)以及殺蟲譜廣等特點(diǎn)，被廣泛用于蔬菜、果樹、棉花和花卉等作物上[2]。

Malanikova等曾使用TLC法檢測阿維菌素，在硅膠薄層板上涂上熒光指示劑，用于樣品檢測。但TLC與高效液相色譜（HPLC）法相比較，靈敏度低，一般只作定性分析，很少用于殘留檢測[3]。根據(jù)阿維菌素類藥物的共軛二烯結(jié)構(gòu)在240～250 nm處有強(qiáng)烈的紫外吸收，常采用液相色譜-紫外檢測分析方法[4，5]。但另一方面，阿維菌素類藥物在體內(nèi)最小有效濃度低于紫外檢測器對其最低檢測限（1～2 ng/mL）[6]。與紫外檢測器相比，熒光檢測器（Fluorescence detector，F(xiàn)LD）的靈敏度約高100倍，對痕量分析特別適用。而且只有具有對稱共軛和非強(qiáng)離子化的化合物才能發(fā)射熒光，因此HPLC-FLD法的基質(zhì)干擾較少。

由于AVM本身沒有對稱共軛結(jié)構(gòu)，不能直接用熒光檢測器檢測，而只有經(jīng)衍生后生成具有對稱共軛的苯環(huán)結(jié)構(gòu)才能發(fā)射熒光，其在血漿中的AVMs檢測限可達(dá)0.02 ng/mL[7]。由于胡椒（Piper nigrum L.）基質(zhì)復(fù)雜，含有大量的揮發(fā)油、胡椒堿、粗脂肪、粗蛋白，對液相色譜柱及檢測結(jié)果產(chǎn)生影響，因此，本試驗(yàn)將圍繞建立胡椒中阿維菌素的檢測方法展開。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

2695高效液相色譜儀，配2475熒光檢測器（Waters，美國），N-EVAP氮吹儀（Organomation，美國），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Heidolph，德國）等。

1.2 主要試劑和材料

甲醇（色譜純），乙腈，二氯甲烷，正己烷，氯化鈉（140 ℃烘烤4 h）均為分析純；阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品（94.7%）等。

NH2-氨基固相萃取柱（Agilent，美國）。

標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制：準(zhǔn)確稱取阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品0.1 g于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。將上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液置于4 ℃冰箱保存。

衍生制劑A：在一具塞試管中加入3.6 mL N， N-二甲基甲酰胺和0.4 mL 1-甲基咪唑，混勻后立即置于冰浴中冷卻1 min，緩緩加入0.6 mL三氟乙酸酐，搖勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。

衍生制劑B：在一具塞刻度試管中加入3 mL甲醇和0.2 mL濃氨水，搖勻。

1.3 方法

1.3.1 樣品提取 稱取10 g胡椒樣品，先后加入5 mL和40 mL乙腈，在勻漿機(jī)中高速勻漿2 min后用濾紙過濾，濾液收集到裝有5～7 g氯化鈉的100 mL具塞量筒中，蓋上塞子，劇烈振蕩1 min，在室溫下靜止10 min，使乙腈相和水相分層[8]。

1.3.2 凈化 取20 mL上清液，轉(zhuǎn)入150 mL分液漏斗后，加入20 mL乙腈飽和的正己烷，充分混勻，分層，取下層于150 mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，37 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸至近干。固相萃取淋洗液為甲醇-二氯甲烷（95/5， V/V，下同），先用4 mL預(yù)淋，當(dāng)溶劑液面到達(dá)吸附層表面時，立即加入樣品溶液，用10 mL具塞刻度試管收集洗脫液，再用2 mL甲醇-二氯甲烷洗燒杯后過柱，并重復(fù)1次。將試管置于40 ℃水浴氮吹。

1.3.3 衍生 向試管中加入0.2 mL衍生試劑A，超聲1 min后，于30 ℃水浴1 h，并不時搖動。取出后再加入0.1 mL衍生試劑B，搖勻。并于30 ℃水浴0.5 h，冷卻至室溫。加入2.5 mL甲醇，振蕩，用0.22 μm濾膜過濾，待測。

1.3.4 色譜分析 流動相為甲醇-水溶液（9/1，V/V），Kinetex C18（50 mm ×4.6 mm， 2.6 μm）色譜柱，柱溫35 ℃，熒光激發(fā)波長為365 nm，發(fā)射波長為475 nm，進(jìn)樣量5 μL，流量0.6 mL/min。

1.3.5 添加回收試驗(yàn) 在空白樣品中添加阿維菌素標(biāo)樣（標(biāo)樣純度為94.7%），按前述分析方法測定回收率。

2 結(jié)果與分析

在上述儀器條件下，阿維菌素的保留時間為6.538 min，標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見圖2，采用外標(biāo)法定量，R2=0.997 1，最低檢測限為0.005 0 mg/kg。其中，圖1-圖4為衍生前氮吹全干情況下。

在添加濃度為0.005、0.010、0.050 mg/kg范圍內(nèi)，胡椒樣品的添加回收率見表1。由表1可知，添加回收率平均值為95%～103%，變異系數(shù)為5.1%～9.3%，滿足農(nóng)藥殘留登記的要求[9]。

在衍生后氮吹近干時，其色譜圖見圖5。由圖5可知，測定加標(biāo)濃度為0.050 mg/kg的樣品時，測得僅為0.001 mg/kg，回收率不足20%，未達(dá)到農(nóng)藥殘留分析的要求。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了胡椒中阿維菌素測定方法，通過乙腈提取，再用乙腈飽和的正己烷進(jìn)行液液萃取去除胡椒中的油脂，以NH2小柱凈化，二氯甲烷-甲醇洗脫，再通過避光衍生，即可進(jìn)行色譜分析。需要注意的是，在衍生之前的氮吹過程中，一定要保證待測樣品完全吹干，可保證回收率為95%～103%，達(dá)到農(nóng)藥殘留分析的要求。

參考文獻(xiàn)：

[1] 吳文君.農(nóng)藥學(xué)原理[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2000.18.

[2] 王險峰.進(jìn)口農(nóng)藥應(yīng)用手冊[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2000. 64-66.

[3] 陳 靜，羅永煌.阿維菌素類藥物在動物性食品中的殘留檢測研究概況[J]. 貴州畜牧獸醫(yī)，2007，31（4）：9-11.

[4] REUVERS T， DIAZ R， DE POZUELO M M， et al. Rapid screening method for ivermectin residue detection in cattle muscle and liver by liquid chromatography with UV detection[J]. Anal Chim Acta，1993，275（2）：353-358.

[5] BERNAL J L， DEL NOZAL M J， SALAS M， et al. HPLC determination of residual ivermectin in cattle dung following subcutaneous injection[J]. Liq Chromatogr，1994，17（4）：2429-2444.

[6] 李俊鎖，錢傳范.牛組織中阿維菌素殘留的ELISA研究[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報，1997，28（1）：77-83.

[7] MONTIGNY P， SHIM J S K， PIVNICHNY J V. Liquid chromatog-raphic determination of ivermectin in animal plasma with trifluoroacetic anhydride and N-methylimidazole as the derivatization reagent[J]. J Pharm Biomed Anal，1990，8（6）：507-511.

[8] NY/T 761-2008. 蔬菜和水果中有機(jī)磷、有機(jī)氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留檢測方法[S].

[9] NY/T 788-2004. 農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則[S].