摘要：采用改進(jìn)的組織外滲電導(dǎo)法，配合Logistic方程，分析比較了12個(gè)柚種質(zhì)資源的抗寒性。結(jié)果表明，供試樣品的低溫半致死溫度集中處在-7.00～-11.00 ℃區(qū)間，且李家河白柚（-10.53 ℃）抗寒性強(qiáng)，金香柚（-9.97 ℃）、廣西劉家沙田柚（-9.36 ℃）較抗寒，廣東沙田柚（-8.88℃）、來(lái)鳳紅心柚（-8.84 ℃）、雜柚

（-8.51 ℃）、四季柚（-8.37 ℃）、福建平和柚（-8.20 ℃）屬于抗寒類型；而臺(tái)灣晚白柚、沙道溝紅心柚、梁山柚、來(lái)鳳白柚的抗寒性相對(duì)較弱。12個(gè)柚種質(zhì)資源的抗寒性強(qiáng)弱排序?yàn)槔罴液影阻?、金香柚、廣西劉家沙田柚、廣東沙田柚、來(lái)鳳紅心柚、雜柚、四季柚、福建平和柚、臺(tái)灣晚白柚、沙道溝紅心柚、梁山柚、來(lái)鳳白柚。

關(guān)鍵詞：柚；種質(zhì)資源；抗寒性；電導(dǎo)法；Logistic方程

中圖分類號(hào)：S666.3；S602.4；Q948.112+.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）02-0342-03

柚[Citrus grandis（L.）Osbeck]是比較適宜在熱帶、亞熱帶地區(qū)生長(zhǎng)的果樹(shù)，其經(jīng)濟(jì)價(jià)值、食用價(jià)值均高，普遍受到生產(chǎn)者與消費(fèi)者的歡迎，因此相關(guān)研究也受到眾多學(xué)者的關(guān)注[1-3]。寒害是柚栽培的重要制約因子，輕則影響幼樹(shù)成長(zhǎng)，導(dǎo)致結(jié)果樹(shù)減產(chǎn)，重則造成樹(shù)體死亡、果園毀滅；加上環(huán)境氣候變化的不確定性，即使現(xiàn)在氣溫較合適的栽培地區(qū)也在研究比較柚栽培品種的抗寒性，不斷尋找較抗寒的柚品種，從而提高現(xiàn)有產(chǎn)區(qū)應(yīng)對(duì)環(huán)境變化的能力，保持柚生產(chǎn)的持續(xù)穩(wěn)定，保護(hù)果農(nóng)的生產(chǎn)積極性，維護(hù)產(chǎn)區(qū)農(nóng)村農(nóng)民的生活穩(wěn)定。有關(guān)柚的抗寒性問(wèn)題，國(guó)內(nèi)外已有研究報(bào)道[4-6]，但多數(shù)是對(duì)現(xiàn)有柚品種的抗寒性進(jìn)行比較，而對(duì)豐富的柚種質(zhì)資源進(jìn)行抗寒特性鑒定的探討尚未見(jiàn)報(bào)道。研究表明，當(dāng)?shù)蜏匕l(fā)生時(shí)，植物細(xì)胞膜的外形和厚度發(fā)生變化，導(dǎo)致膜透性增大，電解質(zhì)大量外滲，外滲量反映了細(xì)胞膜的受傷害程度[7-9]。因此，利用電導(dǎo)法配合Logistic方程求得植物的低溫半致死溫度（Semi-lethal temperature，LT50），可以比較不同植物的抗寒能力強(qiáng)弱[10-12]。試驗(yàn)采用改進(jìn)的組織外滲電導(dǎo)法，配合Logistic方程，通過(guò)化學(xué)檢測(cè)與數(shù)學(xué)分析手段，求得柚種質(zhì)資源葉片電解質(zhì)滲出率隨低溫變化得到的溫度曲線拐點(diǎn)，把拐點(diǎn)作為柚種質(zhì)資源的低溫半致死溫度的估計(jì)值，從而實(shí)現(xiàn)柚抗寒能力的數(shù)量表達(dá)，為柚種質(zhì)資源抗寒特性的挖掘提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

參試的12個(gè)柚種質(zhì)資源均選自鄂西南地區(qū)的宣恩縣、來(lái)鳳縣及宜昌市等地，分別為1號(hào)李家河白柚、2號(hào)來(lái)鳳紅心柚、3號(hào)廣東沙田柚、4號(hào)金香柚、5號(hào)廣西劉家沙田柚、6號(hào)臺(tái)灣晚白柚、7號(hào)沙道溝紅心柚、8號(hào)梁山柚、9號(hào)來(lái)鳳白柚、10號(hào)福建平和柚、11號(hào)雜柚、12號(hào)四季柚，所有參試材料均為嫁接后的二年生枝梢。

1.2 抗寒性測(cè)定

試驗(yàn)于2011年12月開(kāi)始，2012年3月重復(fù)1次；田間選取長(zhǎng)勢(shì)中等的12個(gè)柚種質(zhì)資源單株嫁接樹(shù)，在當(dāng)年生春梢上剪取末端的2～3片生長(zhǎng)正常的葉片，定時(shí)、定樹(shù)取葉樣。葉樣剪下后立即帶回湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心鄂西綜合試驗(yàn)站的實(shí)驗(yàn)室，用自來(lái)水沖洗，然后用蒸餾水洗2次，再用重蒸餾水洗2次，陰干（或用吸水紙擦干），用直徑為0.8 cm的打孔器沿中脈兩側(cè)將葉片切成圓片，混合均勻，每單株取7個(gè)樣，每個(gè)樣稱取0.500 g±0.002 g，裝入洗凈的具塞試管中，蓋上管塞；用冰鹽法將制好的冰分裝入6個(gè)冰壺中，分別加入食用鹽，調(diào)節(jié)溫度分別為-1、-3、-5、-7、-9、-11 ℃，將每個(gè)單株的6個(gè)樣分別放入各溫度梯度冰壺中，蓋上壺蓋，靜置8 h；每個(gè)單株剩余的1個(gè)樣在常溫下靜置8 h作為對(duì)照。然后各單株7個(gè)試管中分別加入15 mL重蒸餾水，蓋上管塞，于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中充分搖動(dòng)10 h；搖動(dòng)完畢取出試管，用DDS-11A電導(dǎo)儀測(cè)葉片的電導(dǎo)率；測(cè)畢，再置水浴鍋中煮15 min，煮畢取出，蓋上管塞，冷卻后再測(cè)煮后的電導(dǎo)率。

1.3 Logistic方程擬合與半致死溫度計(jì)算方法

1.3.1 電解質(zhì)滲出率的計(jì)算 電解質(zhì)滲出率y=（處理電導(dǎo)率-對(duì)照電導(dǎo)率）/（煮后電導(dǎo)率-對(duì)照電導(dǎo)率）×100%。

1.3.2 Logistic方程的選配、計(jì)算及驗(yàn)證 在植物抗寒性研究中，電解質(zhì)滲出率擬合的Logistic回歸方程為y=K/（1+ae-bt）。其中，y為葉片的電解質(zhì)滲出率、t為處理溫度、K為y的最大極限值，a和b為方程參數(shù)。為了確定a、b的數(shù)值，將方程進(jìn)行線性化處理，若y=ln（K-y）/y，則ln [（K-y）/y]=ln a-bt，得細(xì)胞傷害率y1=ln a-bt，則轉(zhuǎn)化為細(xì)胞傷害率與處理溫度的直線方程。因而y與t的符合度可由y1和t的相關(guān)系數(shù)確定，對(duì)相關(guān)系數(shù)進(jìn)行假設(shè)測(cè)驗(yàn)，即可驗(yàn)證選配的方程符合度。通過(guò)直線回歸可求得a、b值及相關(guān)系數(shù)，則可得低溫半致死溫度LT50=ln a/b[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 處理溫度與葉片電解質(zhì)滲出率的關(guān)系

12個(gè)柚種質(zhì)資源單株葉片電解質(zhì)滲出率隨處理溫度的變化測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。從表1可見(jiàn)，隨著溫度的降低，李家河白柚、來(lái)鳳白柚、雜柚等單株在-7～-9 ℃的葉片電解質(zhì)滲出率急速增加，在-9 ℃后增加不明顯；而廣東沙田柚、金香柚、沙道溝紅心柚、福建平和柚等單株在-7 ～-9 ℃的葉片電解質(zhì)滲出率急速增加，并且在-9 ℃后也急速增加；另一部分柚單株如來(lái)鳳紅心柚、廣西劉家沙田柚、梁山柚、四季柚則在-7～-11 ℃區(qū)間的葉片電解質(zhì)滲出率增加不明顯；而臺(tái)灣晚白柚在-7～-9 ℃的葉片電解質(zhì)滲出率平穩(wěn)增加，在-9 ℃后快速增加?？傮w來(lái)看，所有柚種質(zhì)資源單株的葉片電解質(zhì)滲出率隨處理溫度梯度的變化呈現(xiàn)緩慢增加-快速增加-緩慢增加的變化趨勢(shì)，為典型的不對(duì)稱“S”型曲線變化（圖1），符合Logistic曲線的變化規(guī)律。

2.2 由Logistic方程擬合半致死溫度

利用12個(gè)柚種質(zhì)資源單株葉片電解質(zhì)滲出率隨處理溫度梯度變化得到的“S”型曲線，適配Logistic方程進(jìn)行描述[5，6，13]，用數(shù)學(xué)分析方法擬合得到12個(gè)柚種質(zhì)資源單株的低溫半致死溫度，結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可見(jiàn)，12個(gè)柚種質(zhì)資源單株Logistic擬合方程與低溫半致死溫度的相關(guān)系數(shù)均達(dá)到了顯著水平；符合度驗(yàn)證結(jié)果也表明細(xì)胞傷害率與處理溫度存在著真實(shí)的直線回歸和相關(guān)關(guān)系。證明12個(gè)柚種質(zhì)資源單株葉片電解質(zhì)滲出率與處理溫度的變化關(guān)系用Logistic方程描述是可行的，也說(shuō)明抗寒性研究結(jié)果是可靠的。

2.3 柚種質(zhì)資源的抗寒性比較

試驗(yàn)結(jié)果表明，12個(gè)柚種質(zhì)資源單株葉片樣品的抗寒性有一定的差異，各單株的低溫半致死溫度集中處在的區(qū)間為-7.00～-11.00 ℃，其中李家河白柚特抗寒，金香柚、廣西劉家沙田柚較抗寒，廣東沙田柚、來(lái)鳳紅心柚、雜柚、四季柚、福建平和柚屬于抗寒類型，臺(tái)灣晚白柚、沙道溝紅心柚、梁山柚、來(lái)鳳白柚的抗寒性相對(duì)較弱；抗寒性強(qiáng)弱排序?yàn)槔罴液影阻?、金香柚、廣西劉家沙田柚、廣東沙田柚、來(lái)鳳紅心柚、雜柚、四季柚、福建平和柚、臺(tái)灣晚白柚、沙道溝紅心柚、梁山柚、來(lái)鳳白柚。因此李家河白柚、金香柚、廣西劉家沙田柚是抗寒性較優(yōu)的柚資源。

3 討論

3.1 Logistic方程拐點(diǎn)與植物組織傷害程度的關(guān)系

從試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用柚葉片電解質(zhì)滲出率隨處理溫度梯度變化得到的“S”型曲線的曲線拐點(diǎn)所在區(qū)域是段急速上升的曲線，在此溫度區(qū)間，低溫對(duì)葉片細(xì)胞膜的破壞效率最大，導(dǎo)致植物體細(xì)胞膜的不可逆損傷，反映出曲線的拐點(diǎn)（轉(zhuǎn)折點(diǎn)）即是引起膜透性不可逆變化的低溫臨界點(diǎn)，由此可估計(jì)離體植物組織的低溫半致死溫度。而且這一曲線適配Logistic方程進(jìn)行描述，符合度驗(yàn)證結(jié)果可靠。

3.2 關(guān)于柚種質(zhì)資源的抗寒性

本次試驗(yàn)獲得了兩方面的有益啟示，一是柚種質(zhì)資源具有耐驟變低溫能力，即對(duì)突發(fā)性、災(zāi)難性低溫的忍耐能力，這為選育適宜區(qū)域化種植的品種提供了依據(jù)。二是柚種質(zhì)資源具有耐持續(xù)低溫能力，不過(guò)由于試驗(yàn)在室內(nèi)完成，只是一個(gè)模擬結(jié)果，不能全面反映柚在自然條件生長(zhǎng)下的真實(shí)耐寒性；而且植物組織對(duì)低溫的忍耐力除了受低溫持續(xù)時(shí)間的影響外，還與環(huán)境中的光周期、水分、土壤肥力等因素有關(guān)，這方面的研究工作有待深入進(jìn)行。

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